Способ препаративного гель-электрофоретического разделения гипофизарных белков Советский патент 1991 года по МПК G01N33/68 

Изобретение относится к области биохимии, в частности к препаративной биохимии белков, и предназначено для разделения гипофизарных белков.

Цель изобретения - упрощение и ускорение способа.

На фиг. 1 представлен профиль элюции при первичном использовании колонки; на фиг. 2 - то же. при повторном использовании.

Способ осуществляется следующим образом.

Раствор кислого ацетонированного порошка аденогипофизов в кислом буфере А (1,5%-ный раствор уксусной кислоты с 2,5- 3.0 М мочевины и 20% сахарозы, рН 3,2) наслаивают на колонку геля, полимеризо- ванную в аппарате для препаративного гель-электрофореза, например, фирмы Shandon Southern, Великобритания. Гель состоит из 7% акриламида, 0,1 % N.N-мети- лен-бис-акриламида в растворе 2,5-3,0 М

мочевины и 1,5%-ной уксусной кислоты, рН 3,5. Полимеризацию геля осуществляют путем добавления 0,1 % персульфата аммония и 0,1% ТЕМЕД (М,М,М ,М ,-тетраметилэти- лендиамина). Электрофорез ведут при 30- 60 мА и 270-600 В. В качестве верхнего электродного буфера используют раствор 1,5%-ной уксусной кислоты, рН 2,8, нижнего электродного буфера - раствор 10 мМ ацетата аммония и 1,5%-ной уксусной кислоты, рН 3,3. Элюцию и сбор фракций начинают в тот момент, когда лидирующие белковые полосы достигают нижней части геля (полосы видны по рефракции). Элюцию белковых полос проводят с помощью раствора 50 мМ ацетата аммония, 4,5% уксусной кислоты, рН 3,6 со скоростью 1,0 мл/мин. Фракции объемом 4,0 мл собирают с помощью коллектора фракций. Белковые пики регистрируют по поглощению света при длине волны 278 нм. Объединенные белковые фракции подвергают лиофильной сушке.

Ё

Os

го

4 СО

ю

4

Изучение белкового состава полученных фракций проводят с помощью аналитического гель-электрофореза в щелочных условиях.

Пример 1. 14 мг кислого ацетониро- ванного порошка аденогипофизов крыс растворяют в 0,7 мл кислого буфера А с 2,5 М мочевины и наслаивают на колонку геля в аппарате для препаративного электрофореза, которая предварительно подвергнута преэлектрофорезу (без нанесений пробы) в течение 2 ч. Электрофорез ведут при напряжении 410 В, которое подается на электроды с помощью источника питания УИП-1, в результате создается ток силой 40 мА, Сбор фракций заканчивают через 4 ч. Профиль, элюции представлен на фиг. 1. Полученные фракции подвергают лиофильной сушке. Аналитический гель-электрофорез в щелочных условиях показал, что полученные фракции содержат СТГ (соматотропный гормон), ПРЛ, сывороточный альбумин и неидентифицированные белки, что подтверждается также определением N-концевых аминокислот (см. таблицу).

П р и м е р 2. Электрофорез проводят, как и в примере 1, с использованием той же колонки геля, но проба кислого ацетониро- ванного порошка растворена в кислом буфере А с 3.0 М мочевины. Профиль элюции, представленный на фиг. 2, демонстрирует также воспроизводимость способа при повторном использовании колонки геля.

0

Определение состава белковых фракций с помощью аналитического гель-электрофореза (АГЭФ) в щелочных условиях и N-концевых аминокислот представлено в таблице.

Таким образом, способ позволяет ускорить процедуру разделения гипофизарных белков в 3-4 раза и повысить экономичность способа за счет- повторного использования колонки геля.

Формула изобретения С.пособ препаративного гель-электро- форетического разделения гипофизарных

белков путем наслаивания буферного раствора белка на колонку, содержащую по- лимеризованный гель, с последующим разделением элюцией и сбором фракций гипофизарных белков, отличающийся

тем, что, с целью упрощения и ускорения способа, гель получают из 7% акрил амида и 0,1% N.N-метилен-бис-акриламида в растворе 2.5-3.0 М мочевины и 1,5%-ной уксусной кислоты, рН 3,5, гипофизарные

белки растворяют в этом же растворе с добавлением 20% сахарозы, рН 3,2, в качестве верхнего электродного буфера используют 1,5%-ный раствор уксусной кислоты, рН 2.8. в качестве нижнего - 10 мМ

раствор ацетата аммония и 1,5%-ный раствор уксусной кислоты, рН 3,3, а элюцию проводят раствором, содержащим 50 мМ ацетата аммония, 4,5% уксусной кислоты, рНЗ.б.

Изобретение относится к области препаративной биохимии и может быть использовэно для разделения гипофизарных белков Цель - упрощение и ускорение способа, который заключается в проведении препаративного гель-электрофоторетического разделения гипофизарных белков в кислых условиях (рН 3,2-3,5) в присутствии 2,5-3,0 М мочевины. В результате разделения получают 5 белковых фракций (Ai, A2, В, С и D), которые содержат пролактин, соматотро- пин (СТГ), неидентифицированные белки и сывороточный альбумин Изобретение позволяет добиться большей эффективности разработанного способа в связи с выделением большего числа белковых компонентов из гилофизарного экстракта. 2 ил., 1 табл.

Фракции

Состав фракции по АГЭФ

ПРЛ

ПРЛ. СТГ

СТГ, неидентифицированные белки Сывороточный альбумин, неидентифицированный белок СТГ

N-концевые аминокислоты

Лей

Лей, Фен Лей, Фен. Вал, Глу

Гли, Ала

Фен

отн. ед. 0.125

Ц025

Ю

20

U0251L,

Ю

20

3040

/YS фракции

Фаг.1

Фиг. 2

W50

М& фракции.