Способ диагностики мастита Советский патент 1992 года по МПК G01N33/68 

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии, а также может найти применение в молочной промышленности при ветсанэкспертизе молока.

Прототипом заявляемого способа выбран способ диагностики субяинических маститов путем люминесцентно-микроско- пических исследований. Его сущность заключается в следующем: каплю молока наносят на предметное стекло, добавляют равное количество индикатора - акридина- оранжевого в концентрации 10 %, осторожно перемешивают и через 10-15 мин накрывают покровным стеклом и исследуют в сине-фиолетовых лучах под иммерсией - вазелиновым маслом. Далее определяют в молоке лейкоциты, которые имеют интенсивное свечение, при этом ядра светятся ярко зеленым цветом, цитоплазма тускло зеленым, часто с ярко красными включениями. Количество лейкоцитов подсчитывают в 10 полях зрения с последующим опредеСО

с

лением их среднего количества Молоко от здоровых коров содержит в среднем 0,2 лейкоцита на одно поле зрения, от коров с субклиническим маститом - 8,4 лейкоцитов в поле зрения микроскопа. Отдельно учитывают лейкоциты, окрашенные в зеленый и оранжевый цвета. В последнем случае клетки мертвые, которые имеют место в молоке при патологии.

Недостатком прототипа являются низкая точность способа и сложность и длительность его осуществления.

Цель изобретения - ранняя диагностики и повышение точности диагностики мастита.

Новизна и существенные отличия от прототипа заявляемого способа состоят в том, что смесь исследуемой пробы молока с раствором индикатора - бромфенолового синего (БФС) предварительно охлаждают до5-15°С, а затем измеряют интенсивность флуоресценции на длине волны 470 и 540

XI VJ

Ю VJ О

нм. При увеличении интенсивности в зеленой области спектра (540 нм) по сравнению с синей (470 нм) на 20--30% ставят диагноз субклинического мастита, а при разности свыше 30% - диагностируют мастит.

Подробное описание способа и

примеры его конкретного

выполнения.

Пробу молока (от женщины или млекопитающего животного - коровы) объемом 1-2 капли добавляют к 1 мл 0,001-0,01- раствора БФС в пробирку, затем полученную смесь охлаждают до 5-15°С, охлажденную смесь переливают в кварцевую кювету и с помощью флуориметра измеряют интенсивность флуоресценции при длине волны 470 и 540 нм.

Флуоресцентный анализ проводят на лабораторном флуореметре ФЭ-ЗМ, в котором показания микроамперметра пропорциональны интенсивности флуоресценции.

Опытным путем было установлено, что предел концентрации БФС от 0,001 до 0,01% является оптимальным для исследования флуоресценции молока (табл. 1).

Данным способом было установлено, что чистый раствор индикатора (без следов молока) не флуоресцирует, а с молоком дает три максимума флуоресценции: при 660, 540 и 470 нм. При этом в температурном интервале 16,..30°С разность в интенсивности флуоресценции при длине волн 540 нм и 470 нм незначительная по величине и недостоверна, а также не изменяется от качества молока (т.е. полученного от здорового млекопитающего или больного маститом). При охлаждении молока, а именно - в температурном интервале 5-15°С, оно дает с индикатором существенное различие-в интенсивности флуоресценции при 540 и 470 нм в случае получения проб молока от больного животного или женщины с маститом. Причем при субклиническом мастите эта разность составляет 20-30%, при клиническом течении болезни - свыше 30%. В норг ме указанные различия недостоверны.

Данные исследования 45 проб молока от кормящих женщин сведены в табл, 2.

Пример1.К1 мл раствора БФС (0,001%) добавили 1 каплю молока от кормящей женщины. Полученную смесь перемешивали, путем встряхивания пробирки, и охладили в холодильнике до 10°С. Затем пробирку перенести в гнездо флуориметра и измерили интенсивность флуоресценции при длине волны 540 нм и 470 нм. Ее величина составила 60 и 49 отд. ед. соответственно. Разность в интенсивности флуоресценции равна 19%. Женщина практически здорова, что подтверждено последующими анализами.

Пример 2. К1 мл 0,001 %-ного раствора БФС добвили 1 каплю молока от другой

женщины, кормящей грудью. После охлаждения смеси молока и индикатора до 10- 15°С измерилиинтенсивность

флуоресценции в сине-зеленой области спектра (470, 540 нм), которая составила,

0 соответственно, 44 и 55 отн. ед. Разность их равна 20%. Через 3 дня женщина почувствовала боли в области правой молочной железы. При обследовании обнаружено незначительное повышение температуры в

5 этой части тела. Интенсивность флуоресценции пробы молока и индикатора на длине волны 540-нм увеличилась до 65 отн. ед. и по сравнению с ее величиной при 470 нм (45 отн. ед.) разность составила 33%.

0 При люминесцентной микроскопии пробы молока с акридиноранжевым в этот период наблюдений выявлены лейкоциты до трех клеток на поле зрения, что имеет место при клиническом мастите.

5Таким образом, первоначальные значения величины флуоресценции и разность в интенсивности флуоресценции при 540 и 470 нм - 20%, характеризовали субклинический мастит, а последующее увеличение

0 этого показателя до 33% - клиническую стадию болезни.

П р и м е р 3. Проводили флуоресцентный анализ пробы молока от кормящей жен- щины без каких-либо признаков

5 заболевания (мастита). Разбавили 1 каплю молока 1 мл, 0,001 %-ного раствора БФС, полученную смесь молока и индикатора охладили до 10°С. При измерении интенсивности флуоресценции на длинах волн 540 и

0 470 нм установили, что разность между их значениями (соответственно, 50 и 35 отн. ед.) равна 30%. Следовало предполагать, что ее величина соответствует субклиническому маститу. Действительно, через 2 дня

5 женщина почувствовала недомогание и боли в области молочных желез. Отмечена незначительная гиперемия груди. Диагноз - мастит.

Повторный флуоресцентный анализ мо0 лока в растворе индикатора БФС позволил зарегистрировать увеличение сигнала флуоресценции в зеленой части спектра (при 540 нм) на 1-2 отн. ед. Разность в интенсивности флуоресценции при 540 и 470 нм соста5 вила 31-32%.

На основании анализа данных уже этих трех примеров видно, что предлагаемый способ позволяет за 2-3 дня диагностировать скрытую, т.е. субклиническую форму мастита. На этой стадии мастита величина

разности в интенсивности флуоресценции на длине волны 540 нм и и 470 нм соответствует 20-30%, при ее значениях - 31-32 и более имеет место клинический мастит, а ниже 19% -норма.

Пример 4. К1 мл 0,001 %-ного раствора БФС добавили 1 каплю молока от коровы, которое не дает реакции с бромтимоловым синим и другими известными индикаторами на мастит. Полученную смесь молока и БФС в течение 5 мин выдерживали в холодильнике в морозильной камере до температуры 10-15°С, затем провели измерение интенсивности флуоресценции при длине волны 470 и 540 нм. Величина ее равна 60 и 80 отн.сд., соответственно. Разность между их значениями составила 25%, что характеризует субклинический мастит. Через 3-4 дня было отмечено снижение надоев молока и болезненность отдельных долей вымени у коровы. Диагноз - мастит.

Пример 5. К1 мл 0,001 %-ного раствора БФС добавили 1 каплю молока от коровы практически здоровой. После охлаждения смеси до 10°С исследовали интенсивность флуоресценции при длине волны 540 нм и 470 нм, которая была равна, соответственно, 70 и 60 отн.ед., Разность между ними составляет 14%. Диагноз - норма.

Таким образом, преимущества заявляемого способа диагностики мастита сводятся к следующему:

Способ позволяет с высокой точностью (до 100%) диагностировать мастит на субклинической (скрытой) стадии развития его.

Способ прост в выполнении, осуществляется за 10-12 мин, что представляется важным для экспресс-диагностики мастита при массовых обследованиях, а также при определении качества молока на предприятиях молочной промышленности и приемных пунктах молока в хозяйствах.

СпЬсоб может широко использоваться в медицинской и ветеринарной клинике и проводить дифференциальную диагностику мастита.

Формула изобретения

Способ диагностики мастита путем сме- шивания исследуемой пробы молока с индикатором с последующим его люминесцентным исследованием, отличающийся тем, что. с целью ранней диагностики и повышения точности способа, пробу молока смешивают с 0,001-0,01 %-ным водным раствором бром- фенолового синего, охлаждают полученную смесь до 5-15°С и измеряют интенсивность флуоресценции в области спектров 540 нм и 470 нм, и при увеличении первого показателя относительно второго на 20% и более диагностируют мастит.

Использование: в области медицины и ветеринарии и может найти применение в молочной промышленности при ветсанэкс- пертизе молока, Сущность изобретения: пробу молока объемом 1 капли разбавляют раствором бромфенолового синего, охлаждают до , затем измеряют интенсивность флуоресценции раствора и по разности ее величины в зеленой области спектра (540 нм) по сравнению с синей (470 им) на 20-30% диагностируют субклинический мастит, при разности в интенсивности более 30% диагностируют мастит. Применение изобретения позволяет осуществлять экспресс-диагностику мастита при массовых обследованиях, а также определять качество молока. Точность диагностики при этом до 100%. 2 табл.

Интенсивность флуоресценции молока и водного раствора бромфенолового синего в зависимости от концентрации индикатора при комнатной температуре 20°С (отн. ед. )

Таблица 1

Интенсивность флуоресценции молока и 0,001 % растворе

БФС (соотношение 1:20) в сине-зеленой области спектра

при различной температуре среды и формах мастита ()

Таблица 2