Способ определения активности мышиного токсина чумного микроба Советский патент 1992 года по МПК C12Q1/00 

Изобретение относится к микробиологии, в частности к изучению активности действия бактериальных токсинов.

При излучении бактериальных токсинов в качестве индикаторных систем часто используются культуры клеток, как высокочувствительные, стандартные и воспроизводимые модели.

Известно использование для изучения действия холерного токсина и термолабильного эитеротоксина Е. со клеточной культуры СНО (Guerrat R.L.. Branton L.L.. J. Inf. Dis., 1977, v. 135, p. 720-728), Vero (German) Y., Dassy B. Ann. Mickrobiol (Inst. Pasteur) 1984, v. 135 B, p. 291-295) и других линий, основанное на специфическом изменении морфологии клеток (удлинение или округление) под действием токсина.

Однако попытки использовать клеточные системы для определения действия мышиного токсина чумного микроба оказались безрезультатными (Montie T.C. J. Intern.

Encycl. Pharmacol. Ther., 1981, v. 12, N3, p. 491-499. Сальникова О.И., Рожков К, К., Алу- тин И.М. и др. В кн.: Бактериальные токсины. Тез. докл. 2 Всесоюзн. конф. Юрмала, 1989.-С. 115).

Известен способ для определения активности мышиного токсина чумного микроба на животных (Montie T.C., Ajl S.J. Nature and synthesis of murine toxins of Pasteurella pestis. Microblal toxins. N.Y., London, 1970, v. III. Bacteria protein toxins. Ch. 1-a).

Самкам белых мышей весом 16-18 г внутрибрюшинно (или внутривенно) вводят ряд разведений препарата. Препарат одного разведения сводят 6 животным. Число павших мышей на разведение регистрируют через 24 ч, LDso выражают в микрограммах белка, определенного по методу Лоури, необходимого, чтобы убить 50% мышей и рассчитывают по разведениям.

Однако этот способ имеет ряд недостатков, связанных с тем, что используется биосл

nsaa

СП

ю

логическая система (лабораторные животные), которую трудно стандартизировать по возрасту, полу, биологической активности. Последняя подвержена сезонным колебаниям и зависит от условий содержания животных (особенно температурного режима и питания). Кроме того, исследуются малые выборки животных из популяции, Все это ведет к низкой воспроизводимости результатов. Недостатком способа является его трудоемкость, связанная с содержанием лабораторных животных.

Целью изобретения является повышение достоверности за счет стандартизации способа и увеличения объема выборки исс- ледуемого биологического объекта.

Настоящая цель достигается тем, что в качестве биологической модели используют культуру клеток, изменяющих морфологию под действиам холерного токсина, а оценку активности ведут по тормозящему действию мышиного токсина на изменение морфологии клеток.

Способ осуществляется следующим образом. Клеточную культуру, выращенную в ростовой среде с 10% сыворотки плода коровы, переносят в культуральные панели с ростовой средой, содержащей 1 % сыворотки и инкубируют при температуре 18-38° С в течение 5-60 мин. с препаратом мыцшно- го токсина возбудителя чумы в дозе 0,1-0,5 LDso. определенной титрованием на белых мышах, затем в эту смесь добавляют холерный токсин в дозе, вызывающей достоверные изменения морфологии клеток (удлинение для СНО, округление для Vero). Активность действия мышиного токсина оценивают по степени торможения им морфологических изменений клеток под действием холерного токсина в опытной и контрольной (с кипяченым препаратом мышиного токсина) пробах.

Пример 1. Суспензию клеток ( кл/мл среды Игла, содержащей 1% сыворотки коровы) СНО (CHO-KI, институт Цито- логии АН СССР, г. Ленинград) в объеме 50 мкл вносили в лунки 96-луночной культу- ральной плоскодонной панели (Llnbro). Добавляли 50 мкл раствора мышиного токсина содержащего 0,1 LDso по данным внутри- брюшинного титрования на белых мышах и инкубировали 5 мин при 38° С. Затем вносили 50 мкл раствора холерного токсина в дозе, вызывающей изменения (удлинение в 2-3 раза) 15% клеток популяции СНО.

В качестве контроля клеток использова- тели 50 мкл суспензии клеток СНО (6.10 кл/мл), к которой добавляли 50 мкл растворителей холерного и мышиного токсинов, в

данном случае -5мМ раствор трис-HCI буфера, рН 7,2.

В качестве контроля действия холерного токсина брали 100 мкл суспензии клеток СНО (3 104 кл/мл), добавляли дозу холерного токсина, используемого в опыте в объеме 50 мкл.

В качестве контроля действия мышиного токсина в 100 мкл суспензии клеток СНО (3.104 кл/мл) добавляли дозу мышиного токсина, используемого в опыте в объеме 50 мкл.

Для контроля специфичности действия мышиного токсина использовали кипяченый в течение 5 мин препарат мышиного токсина.

Контроль взаимодействия токсинов друг с другом осуществляли в следующих вариантах:

а -токсины предварительно смешивали, добавляли эту смесь в культуру клеток и инкубировали;

б - токсины смешивали, инкубировали и обрабатывали этой смесью клеток;

в - культуру клеток инкубировали с холерным токсином, а затем добавляли мышиный токсин.

Дозу и объемы токсинов, а также время и температура инкубации соответствовали таковым в опытной пробе примера.

Панель помещали в 5 % СОа при 37° С на ночь. Затем считали с помощью инверти- рова,нного микроскопа количество клеток, изменивших морфологию в опыте и контро- лях. Для этого подсчитывали по 400 клеток в трех полях зрения в каждой лунке с 2-4 параллельными.

В результате учета оказалось, что в предлагаемом нами способе изменили морфологию 10,0 ±2,0 %, в контроле клеток - 9,0 ± 1,9 %, в контроле действия холерного токсина - 15,0 ±2,4 %, в контроле действия мышиного токсина-9,9 ± 1,8 %,в контроле специфичности - 15.7 ±2,5 %, в контролях взаимного слияния токсинов друг на друга вариант а - 14,7 ± 2,4 %. вариант б - 14,0 ±1.8 %, вариант в - 15,4 ±2,5 %.

Таким образом, мышиный токсин в дозе 0,1 LDso достоверно защищал клетки СНО от действия холерного токсина, вызывающего удлинение 15 % клеток, реакция носит специфический характер; использованная в опыте последовательность обработки клеточной культуры токсинами обоснована; мышиный токсин не оказывает прямого ин- гибирующего (или активирующего) действия на холерный токсин.

Пример 2. Условия опыта и система контролей, как описано в примере 1, но

клетки СНО инкубировали с препаратом мышиного токсина в дозе 2 LDso 30 мин при 37° С. Холерный токсин использовали в дозе, вызывающей изменение морфологии половины клеток в популяции В результате подсчета оказалось, что в опытной пробе изменили морфологию 11,0 ± 2,0 % клеток, в контроле клеток - 8,5 ±1,7 %, в контроле действия холерного токсина - 50,0 ±2,4 %, в контроле действия мышиного токсина - 9,0 ±1,8 %, в контроле специфичности реакции - 52,2 ±2,0 %, в контролях взаимного влияния токсинов друг на друга: а 53.0± 2,4 % , вариант б - 50,0 ±1.8 %, вариант в - 51,0± 1,8 %.

Таким образом, мышиный токсин в дозе 2 LDso достоверно защищает клетки СНО от действия холерного токсина, вызывающего изменение 50 % клеточной популяции; реакция является специфичной, используемая в опыте последовательность обработки клеточной культуры - обоснованной: мышиный токсин не оказывает прямого ингибирующе- го действия на холерный токсин.

Пример 3. Условия постановки опыта и системы контролей как в примере 1, но клетки СНО инкубировали с препаратом мышиного токсина в дозе 5 LDso 60 мин при 18° С, а затем вносили препарат холерного токсина в минимальной дозе, вызывающей максимальный эффект (удлинение примерно 70 % клеток в популяции)

При уче.е результатов выяснилось, что в опытной пробе изменили морфологию 35,5 ±3,2 % клеток в популяции, в контроле клеток - 10,0 ±2,0 %, в контроле действия препарата холерного токсина-70,0 ±3,5 %, в контроле действия мышиного токсина - 9,0 ± 3,0 %, в контроле специфичности 69.1±5,4 %, в контролях взаимного влияния токсинов друг на друга: а - 68,2 ±2,0 %; в варианте ,3 ±3,5 %, в варианте ,0 ±2,2 %.

Таким образом, препарат мышиного токсина в дозе 5 LDso достоверно понижал реакцию клеток на холерный токсин в дозе, вызывающей изменение 70 % клеток популяции; реакция носит специфический характер; последовательность обработки клеточной культуры обоснована; мышиный токсин не оказывает прямого ингибирующе- го (или активирующего) действия на холерный токсин.

Пример 4. Для опыта использовали культуру клеток Vero (институт Цитологии АН СССР, г. Ленинград). Учет клеточной реакции оценивали в 4-х бальной системе по степени изменения клеточного монослоя. Суточный монослой культуры Vero при посевной дозе 15-10 кл/мл в объеме 100 мкл среды Игла, содержащей 1 % сыворотки плода коровы, инкубировали с 25 мкл препарата мышиного токсина в дозе 2 LDso при 5 37° С в течение 30 мин. Затем добавляли 25 мкл холерного токсина в дозе, вызывающей изменения морфологии (округление) примерно половины клеток популяции (реакция на 2 балла). Условия культивирования, как

0 система контролен аналогичны описанным в примере 1.

При учете результатов оказалось, что в опытной пробе изменений клеточной морфологии не наблюдалось, в контроле клеток

5 - тоже, в контроле действия холерного токсина отмечены изменения на 2 балла, в контроле действия мышиного токсина изменений монослоя не было, в контроле специфичности отмечены изменения на 2

0 балла, в контролях взаимного влияния токсинов друг на друга: вариант а - изменения на 2 балла, вариант б - изменения на 2 балла, вариант в - изменения на 2 балла Таким образом, мышиный токсин в дозе

5 2 LDso полностью защищает клетки Vero от действия холерного токсина, вызывающего изменения морфологии клеток Vero на 2 балла, реакция специфична, прямого инги- бирующего (или активирующего) действия

0 холерного токсина мышиным не отмечено. Пример 5. Объемы проб, доза клеток и способ испытания препаратов в культуре клеток СНО аналогичны описанным в примере 1. Для количественного препарата мы5 шиного токсина сначала находят цитотоническую единицу холерного токсина (ЦТЕбО XT). Для этого двухкратные разведения препарата холерного токсина (XT) (8 мкг/мл) испытывают в системе клеток СНО.

0 Рассчитывают дозу холерного токсина, вызывающую 50 % изменение морфологии клеток и ее доверительные интервалы (Боярский А.Я., 1955, с. 243-249, при п 1200 подсчитанных клеток на каждую дозу и р

5 0,05, с применением системы пробитое (Аш- марин И.П., Воробьев А.А , 1962, с. 93-104, 173). Как видно из рис. 1, она составляет 5,15 (6,3-4,4) нг/мл при разведении XT 1 : 1550(1 : 1780- 1 : 1260), которое вызывает

0 50,0 ± 3,2 % удлинения клеток популяции. Затем двухкратные разведения препарата (2,5-0,00195 мкг/лунка) мышиного токсина (LDso 2 мкг) вносят в лунки с клетками СНО. После 30 мин инкубации при37°Св

5 лунки добавляют холерный токсин в дозе, равной 2 UTEso XT (1 : 890 - 1 : 630), что соответствует 10,3 (12,7-9,0) нг/мл, вызывающей 62,0 ± 3,1 % удлинении клеток популяции. После ночной инкубации панель

микроскопируют и определяют статистически достоверную дозу мышиного токсина, снижающую процент Удлиненных клеток до 50 % уровня. Эту дозу считают эквивалентной 1 ЦТЕзо XT, она составляет 0,18 (0,16- 0,21) мкг.

Таким образом, на предложенной модели клеточной культуры СНО получена количественная характеристика антицитотонического (антихолерогенного) действия мышиного токсина.

Формула изобретения Способ определения активности мышиного токсина чумного микроба путем введе0

5

ния исследуемого токсина в биологическую модель и оценки результатов, отличаю щ и и с я тем, что, с целью повышения достоверности за счет стандартизации способа, в качестве биологической модели используют культуру клеток, чувствительных к действию холерного токсина, после введения мышиного токсина культуру инкубируют в течение 5-60 мин при 18-38° С, далее добавляют холерный токсин в дозе, вызывающей морфологические изменения у 15-73,5 % клеток культуры, и определяют активность мышиного токсина по количеству морфологически измененных клеток.

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для изучения активности чумного токсина. Сущность изобретения: клеточную культуру, индикаторную к холерному токсину, обрабатывают мышиным (чумным) токсином в дозе 0,1-5 ЛД, инкубируют 5-60 мин. при 18-38° С, затем добавляют холерный токсин в дозе, индуцирующей морфологические изменения в культуре, а результаты оценивают по степени торможения морфологических изменений в опытной и контрольной пробах.