Способ определения количества живых клеток микроорганизмов Советский патент 1992 года по МПК C12Q1/04 

Изобретение относится к области микробиологии и может быть использовано для быстрого определения микроколичеств живых клеток в смесях, состоящих из микроорганизмов различных видов, родов и семейств,в медицинской микробиологии, биотехнологии и охране окружающей среды.

Цель изобретения - повышение чувствительности, достоверности способа и определение количества живых клеток микроорганизмов в смесях.

Способ включает введение в исследуемую пробу одновременно два или более флуорогенных субстрата в зависимости от числа видов микроорганизмов, присутствующих в пробе, инкубирование пробы, измерение суммарной величины флуоресценции и определение по ней количества живых клеток микроорганизмов.

Смесь флуорогенных субстратов позволяет выявить живые клетки даже в

том случае,когда они не обладают ферментами для расцепления какого-либо из используемых флуорогенных субстратов.

Пример 1. К 3 мл смеси клеток E.coli М-17 и Pseudononas auran- tica,приготовленной на дистиллированной воде,добавляют 0,1 мл раствора 4-метилумбеллиферилфосфата (0,1 мг/мл в этаноле) и 0,1 мл раствопа й-мети- лумбеллиферилбутирата (0,1 мг/мл в ,этаноле). К другим 3 мл такой же смеси клеток,предварительно прогретой до 100°С (1 минута) и охлажденной до комнатной температуры,добавляют аналогичные количества t-метилумбеллифе- рилфосфата и -метилумбеллиферилбу- тирата. Обе проПирки помещают в водяную баню при t 40°C на 15 мин. После этого пробы быстро охлампают до ч-6 С и Алуориметрируют. ,ллина волны возбуждения флуориметра устанавливается на 320 нм, длина волны флуоресЁ

СО

о

циннии нм. Из величины флуоресценции первой пробы вычитпют величину Флуоресценции второй пробы (фоновой Флуоресценции). Полученная величина соответствует истинному количеству иивых клеток в исследуемом образце, которое находится по предварительно составленному калибровочному графику. В спучае использования только -метилумбеллиферилфосфата определяются только клетки E.colis клетки Pseudomonas aurantica не определяются. В случае использования Только 4 метилумбеллиферилацетата определяются только клетки Pseudomonas aurac- tica но не E.coli. Таким образом, истинное количество живых клеток в данной суспензии можно определить только смесью двух соответствующих флуоро- генных субстратов.

Пример 2. Производство кормового белка осуществляют на основе одного из видов рода Candida. Однако в процессе ферментации в среде обнаруживают большое количество клеток Candida других видов. После стадии плазмолиза необходимо выявить общее количество живых клеток в продукте. Наибольшие активности клеток рода Candida - эстеразная и липазная. Они наилучшим образом выявляются с помощью t-метилумбеллифорилацетата (k МУЛ) и 4-метилумбеллиферилбутирата (А-МУЬ).

Однако они гидролизуются различными видами рода Candida неодинаково, например

-НУА 4-МУБ- Candida 1p.1 55 70 Candida 1р. 2 8 Candida 1р.З 28 12 Candida 1р.4 26 26 Candida 1р.5 21 66 Следовательно, наиболее достоверно количество клеток живых можно определить с помощью смеси 4-МУ А и 4-МУБ.

С этой целью готовят две пробирки плазмолизированной взвеси по 3 мл каждая. Одну из них (контрольная) прогревают 10 мин на кипящей водяной бане. Затем, к каждой добавляют по 0,1 мл. фосфатного буфера с рН 5,4 и по 0,1 мл 4-МУА и 4-ИУБ с концентрацией 0,1 мг/мл этанола. Пробы инкубируют 1 ч при 37°С. Затем к каждой

пробирке добавляют 6 fin 1/15 молярного раствора Гта2НРОц,. Далее пробы центрифугируют 10 минут при 8000 об/мин. Надосадочные жидкости флуориметрируют (ft 366 нм и flcp. 52 нм). Из величины флуоресценции первой пробы вычитают величину Флуоресценции контрольной пробы.

Полученное значение флуоресценции соответствует количеству «ивых клеток в исследуемом образце. Таким образом могут быть выявлены концентрации живых клеток вплоть до 103 кл/мл.

g Предлагаемый способ определения живых клеток микроорганизмов отличается высокой чувствительностью, экс- пресностью и достоверностью определения.

л Способ может найти применение для контроля качества пастерилизации, плазмолиза, стерилизации продукции или производственных емкостей в медицинской, микробиологической и пищевой

5 промышленности, так как позволяет достоверно определять исключительно малые количества выживших микроорганизмов и достаточно полно определить общее количество живых клеток всех виQ дов и родов микроорганизмов, находящихся на обрабатываемых объектах.

Экспрессное,чувствительное и достоверное определение общего количества живых клеток микроорганизмов имеет больиое значение для оперлтив5

ного принятия соответствующих мер,

формула изобретения

f

Способ определения количества живых клеток микроорганизмов, включающий введение в исследуемую пробу флуорогенного субстрата, инкубирование смеси, измерение величины Флуоресценции и определение по ней количества живых клеток микроорганизмов, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа за счет возможности учета различных видов микрофлоры в исследуемой пробе, в пробу вводят одновременно два или более флуорогенных субстрата в зависимости от числа видов микроорганизмов, присутствующих в пробе, и измеряют суммарную величину

флуоресценции.

Использование: медицина, биотехнология, охрана окружающей среды. Сущность изобретения: в исследуемую пробу, зараженную различными видами микроорганизмов, вводят одновременно два или более флуорогенных субстрата. Выбор субстратов зависит от числа видов микроорганизмов, присутствующих в пробе. Измеряют суммарную величину флуоресценции. При этой величине определяют количество живых клеток микроорганизмов в исследуемой пробе.