Способ оценки устойчивости кукурузы к злаковым тлям Советский патент 1992 года по МПК A01G7/00 A01H1/04 

Изобретение, относится к физиологии и биохимии растений и может быть использовано в области селекции растений на устойчивость. Известен способ устойчивости кукурузы к стеблевому мотыльку, основанный на определении концентраций соединений вторичного метаболизма 6-метоксибензокса- золинонов в листьях взрослых растений, он требует использования малоинформативного и трудоемкого метода бумажном хроматографии и применения 2%-ного хлорного железа. Определение проводится на основании визуальной оценки размера и интенсивности свечения хроматографических пятен на хроматограммах, полученных из вытяжек сортов кукурузы с известной и неизвестной степенью устойчивости, оцениваемой в баллах Метод связан с применением хроматографии на бумаге, занимающей, как правило, от 10 до 48 ч. Кроме того, данный метод обладает низкой эффективностью разделения и не позволяет проводить количественного анализа исследуемых соединений, Известен способ, основанный также на определена концентраций циклических гидроксаматов (ДИМБОА и МБОА) в растениях кукурузы, связанный с использованием фотометрии Этот способ, взятый за прототип, трудоемок и малоэффектиЕ ен. так как требует большого количества материала, большой подготовительной работы (более суточ) а также не позволяет выявить физиологических барьеров устойчивости кукурузы к вредителям. Кроме указанных недостатков фотометрический метод определения не селективен для анализируемых соединений по причине присутствия большого количества примесей, содержащихся в растите/ ьных экстрактах искажающих результаты а-)али за Следует также отметить что данные методы были разработаны для оценки степени устойчивости кукурузы к стеблевому мотыльку. Предлагаемый способ предн.ззча- чен для оценки степени устойчивости кукурузы к другому вредителю - злаковом тле.

а

КЗ

Целью изобретения является возможность определения устойчивости кукурузы к злаковым тлям и повышение точности анализа на основании регистрации изменений содержания природных фитогормонов ци- токининов в неповрежденных и поврежденных вредителями растительных тканях методов высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Поставленная цель достигается тем, что анализируются листья контрастных по устойчивости линий кукурузы, поврежденной и неповрежденной тлями, с помощью метода ВЭЖХ.

Критерием устойчивости служит степень изменения эндогенного уровня цитоки- нинов (зеатина и зеатин-рибозида) в листьях контрастных по устойчивости линий кукурузы, подвергнутых воздействию вредителей. Других аналогов с подобными при- знаками не обнаружено. Зеатин и зеатин-рибозид, являющиеся растительными гормонами, в качестве биохимического показателя устойчивости ранее не использовались. По сравнению с прототипом пред- лагаемый способ наряду с меньшей трудоемкостью и большей экономичностью обладает более широкой информативностью, позволяющей проводить не только качественную, но и количественную оценку содержания анализируемых соединений. Количественное определение эндогенных цитокининов, выполненное методом ВЭЖХ, отличается высокой воспроизводимостью и требует небольшого времени для анализа (от 10 до 20 мин на одну пробу). Подготовительные процедуры (экстракция, фильтрация и фракционирование, необходимые для приготовления 30 проб, занимают один рабочий день. Анализ образцов можно проводить в любое время года, так как используемый материал может храниться в эксикаторах в сухом виде несколько лет. Подсчет концентраций соединений проводится автоматически с использованием интегратора, что позволяет проводить точную количественную оценку содержания анализируемых веществ, а не ограничиваться качественным содержанием цитокининов. Преимуществом предлагаемого способа по сравнению с прототипом служит точная качественная и количественная оценка содержания зеатина и зеатин-рибозида, которые как известно, являются маркерами физиологического состояния растений. Способ, описанный в прототипе, основан на определении в растительных тканях циклических гидроксаматов, которые, в отличие от фитогормонов, обладают не регуляторными, а узко антибиотическими свойствами.

Преимуществом предлагаемого способа по сравнению с прототипом является то, что он позволяет в быстрый срок определить ответную реакцию кукурузы на повреждение ее сосущими вредителями, которая выражается в неадекватном ответе различных по устойчивости линиях растений на изменение эндогенного уровня зеатина и зеатин-рибозида. Последнее отражает

физиологическое состояние растения по аналогии с изменениями гормонального уровня животных клеток, подвергнутых неблагоприятным воздействием, Использование метода ВЭЖХ позволяетанализировать

небольшие количества растительного материала: 50-200 мг сухого веса ткани.

Сущность предложенного способа заключается в том, что для оценки образцов кукурузы используются спиртовые экстракты, полученные либо из лиофильно высушенных, либо из свежих листьев кукурузы, которые фиксируются и экстрагируются спиртом. Полученные экстракты упариваются до водной фазы, а затем подщелачивали

1н. КОН до рН 8 и экстрагировали н-бугано- лом, который упаривали досуха. Сухой остаток растворяли в смеси ацетонитрила и воды и вводили в хроматограф. После хро- матографического анализа подводили подсчет концентраций полученных пиков по следующей формуле: г Si С2 V2

1 S2ViP где Ci - концентрация анализируемого вещества в пробе, мкг/г;

С2 концентрация стандартного вещества (синтетического зеатина или зеатин-рибозида) в аликвоте пробы, мкг:

51- площадь пика анализируемого ве- щества, мм:

52- площадь пика стандартного веще- ства (зеатина или зеатин-рибозида), мм:

Vi - общий объем пробы, мкл:

/2 - объем аликвоты пробы, мкл: Р - навеска, г.

Анализ проводился в 3-кратной позтор- ности.

Критерием устойчивости линии служит увеличение концентрации зеатина или зеа- тин-рибозида в тканях при их повреждении тлями, критерием неустойчивости - снижение содержания этих веществ. Достоверность увеличения или снижения содержания цитокининов доказывается с 5 использованиемоднофакторногодисперсионного анализа.

Пример 1. Для анализа цитокининов (зеатина и зеагин-рибозида) используются апикальные листья устойчивой линии кукурузы А-619, поврежденные и неповрежденные злаковыми тлями. Нагрузка оценивалась в баллах по стандартной методике. Балл повреждения составлял 4. Листья лио- фильно высушивали, взвешивали, брали 50 г и экстрагировали этиловым спиртом; экстракты упаривали до водной фазы, подщелачивали 1н. КОН до рН 8 и экстрагировали н-бутанолом, который упаривали досуха. Сухой остаток растворяли в 3 мл смеси аце- тонитрила и воды (1:); часть которой (20 мкл) вводили в хроматограф модели НРР-5001 (ЧССР). Анализ проводили при следующих условиях: скорость потока жидкой фазы (ацетонитрила, воды и уксусной кислоты в соотношении 55-44-1) 1 мл/мин, среднее давление 70 бар, Режим изократический. Применяли колонки фирмы Serva размером 4,6x250 мм. заполненные твердым носителем Octadecyl Si 100 Polyol с размером частиц 5 мкм, а также колонки производства ЧССР типа С-18 размером 4.6 х150 мм. заполненные твердым носителем SGX Separon размером 3 мкм. Детектирование проводили в УФ-свете при длине волны Я 254 нм. Объем вводимой в хроматограф пробы 20 мкл. Калибровочные растворы синтетических зеатина и зеатин-рибозида, необходимые для калибровки прибора, содержали 0,1; 0,2; 0,5 мкг/аликвоте. Подсчет концентраций исследуемых соединений проводили на основании вычисления площадей пиков и коэффициентов разбавления. Обработку полученных данных проводили, подсчитывая среднюю арифметическую (х), ошибку средней (Sx), стандартное отклонение (Sx), достоверность средней (tx), вариабельность (V). Затем проводили однофакторный дисперсионный анализ для доказательства того, что воздействие сосущих вредителей на кукурузу достоверно влияет на изменение содержания цитокини- нов в листьях (при р 0,01).

Пример 2. То же. что и в примере 1. Берут 50мгсухого растительного материала (высушенные лиофильно апикальные листья) неустойчивой линии WF-9, поврежденного и неповрежденного злаковыми тлями. Балл повреждения 4. Фиксацию, экстракцию, фракционирование, последующие этапы очистки экстракта и хроматографиче- ский анализ с помощью ВЭЖХ проводится аналогично примеру 1.

Критерием неустойчивости линии служит уменьшение или отсутствие изменений в содержании цитокининов (зеатина, зеатин-рибозида) в тканях при их повреждении

вредителем. Достоверность доказывается, как и в примере 1, с помощью однофактор- ного дисперсионного анализа. На фиг. 1 приведенные данные по содержанию эндогенных цитокининов:зеатин-рибозида и зеатина в контрольных 1 и 2 и поврежденных 3 и 4 тлями листьях кукурузы (в мкг/г сухого веса ткани). В табл. 1 приведены данные по изменению содержания зеатина и зеатин- рибозида. а также их суммы в различных по

устойчивости линиях кукурузы при повреждении ее тлями (в % по отношению к контролю). На фиг. 2 представлены данные по изменению суммы эндогенных цитокининов зеатин-рибозида и зеатина в поврежденных злаковыми тлями апикальных листьях кукурузы устойчивых (А-619, 2039А-14АУ, Р-346)и неустойчивых W-9, WF-117, МБ-385 линий (в %). Полевой способ оценки устойчивости кукурузы к злаковым тлям приурочен к определенному периоду вегетации растений и является достаточно трудоемким в силу специфики проведения энтомологических экспериментов, требующих очень много времени для оценки устойчивости образцов. Предлагаемый способ оценки устойчивости кукурузы к злаковым тлям принципиально отличается от указанного выше способа не только более точным критерием устойчивости, но и независимым от сезона ходом выполнения анализа.

Формула изобретения Способ оценки устойчивости кукурузы к

злаковым тлям, включающий анализ растений, поврежденных вредителем, отличающийся тем, что. с целью упрощения способа и повышения его точности, растения анализируют на содержание зеатина и

зеатин-рибозида, дополнительно анализируют неповрежденные растения на содержание тех же цитокининов и как устойчивые оценивают растения, у которых увеличивается содержание зеатина и зеатин-рибозида в ответ на повреждение, а как неустойчивые оценивают растения, у которых уменьшается или отсутствует изменение в содержании цитокининов.

Примичания:В устойчивых формах кукурузы при повреждении тлями происходит увеличение содержания суммы цитокининов на 39,6 -124,6% по отношению к контролю, в неустойчивых -снижение на 8,4 -35,6%.

Использование, физиология и биохимия растений, способы селекции растений на устойчивость. Сущность изобретения: поврежденные вредители растения анализируют на содержание зеатина и зеатин-рибозида. Дополнительно анализируют неповрежденные растения на содержание тех же цитокининов. Как устойчивые оценивают растения, у которых увеличивается содержание зеатина и зеатин-рибозида в ответ на повреждение и как неустойчивые оценивают растения у которых уменьшается или отсутствует изменение в содержании цитокининов 2 табл , 2 Фиг

мкг/г 1№

А-61 9 г039Л-1Ш Р-Мб

Фиг.1

W-3 WF-117 М6-385

A-81S 2039А Р-МВ

ту

Фиг.Ј

W-9 №-Ш Мб-385