СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ РАКОВОЭМБРИОНАЛЬНОГО АНТИГЕНА ПРИ ПОМОЩИ СПЕЦИАЛЬНОГО АНТИТЕЛЬНОГО ДИАГНОСТИКУМА Российский патент 1997 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, к способам диагностики, а именно, к иммунологическому анализу с помощью лекарственных препаратов, содержащих носители, связанные с антителами, и может быть использовано для выявления лиц с наличием опухолей продуцентов раково-эмбрионального антигена (РЭА). Опухолевой антиген РЭА является гликопротеином с М.В.200000 дальтон. В крови здоровых людей может обнаруживаться по нашим и литературным (1) данным в концентрациях от 0 до 20 нг/мл (при определении методом радиоимунного анализа), а увеличение его концентрации свыше 40 нг/мл свидетельствует о наличии злокачественного опухолевого процесса в организме.

Известен способ радиоиммунологического анализа (РИА), для определения концентрации РЭА у человека. Способ включает смешивание сыворотки крови человека со специфическими антителами, меченными радиоактивными изотопами, с последующей инкубацией, разделением, радиометрией и регистрацией результатов (2).

Способ позволяет определить уровень РЭА от 0 до 360 и более нг/мл в сыворотке крови обследуемых.

Однако, широкое использованием этого метода, в том числе и в процессе всеобщей диспансеризации, практически не осуществимо из-за отсутствия в стране достаточно развитой сети радиоиммунологических диагностических лабораторий; ограниченного количества и дороговизны выпускаемых в стране и приобретаемых за рубежом радиоиммунных наборов и относительно высокой стоимости аппаратуры для этих исследований; опасности для здоровья, которую представляет сама процедура мечения белка радионуклидом, подготовка и выполнение радиоиммунологических анализов; необходимости наличия специальных помещений, оборудования, средств защиты персонала, способов транспортировки и захоронения радиоактивных отходов.

Совокупность всех перечисленных факторов побуждает к поиску других носителей антител для приготовления антительного диагностикума, используемого в реакции АГА.

Авторами проведена работа по исследованию других носителей (эритроцитов кроликов, барана, птиц кур и голубей), обладающих способностью адсорбировать на своей поверхности антитела. Из перечисленных видов эритроцитов, наиболее соответствующими задачам анализа оказались эритроциты кур. Использование эритроцитов кур позволяет добиться удешевления и упрощения способа обнаружения РЭА за счет использования общедоступного сырья для приготовления эритроцитарного антительного диагностикума.

Поставленная задача решается тем, что в способе выявления РЭА у человека производится смешивание пробы сыворотки крови обследуемого со специфическими антителами, связанными с эритроцитами и последующей регистрацией результатом взаимодействия антиге антитело в реакции АГА. Антительный эритроцитарный диагностикум получают путем обработки глютаральдегидом эритроцитов крови 1 - 2-х летних кур и присоединения к ним анти-РЭА-антител.

Суть изобретения заключается в том, что исследованы и выбраны эритроциты кур, обладающие высокой адсорбционной активностью и минимальной способностью к перекрестным реакциям с тканями человека.

Забор куриной крови, являющейся одним из отходов производства птицефабрик, не требует стерильного оборудования и других вышеперечисленных факторов, упомянутых при заборе крови у людей. Технология забора крови у кур приводит к значительному удешевлению одного из основных компонентов (эритроцитов) реакции АГА.

Все остальные этапы подготовки реагентов для постановки реакции АГА не имеют существенного отличия от прототипа.

Таким образом, использование куриных эритроцитов вместо человеческих устраняет риск инфекцирования доноров и мед. персонала инфекционными агентами, упрощает технологический процесс приготовления реактивов и удешевляет стоимость реакции.

Эритроциты кур получают путем обезглавливания животных с последующим заборов крови в среду Ольсевера, в соотношении 1:2. Кровь фильтруют, получают из нее эритроциты, которые 10-ти кратно отмывают физиологическим раствором с центрифугированием при 4000 об/мин. К полученному осадку эритроцитов добавляют двухкратный объем физиологического раствора с рН=7,2, содержащий 0,25% раствор глютаральдегида, взвесь перемешивают, инкубируют 3 часа при температуре 37^o C. После инкубации эритроциты отмывают 4 раза физиологическим раствором в соотношении 1:10, затем добавляют к осадку эритроцитов физиологический раствор до получения 8%-ной суспензии. Для консервации добавляют мертиолат натрия до получения конечной концентрации его 1:10000.

Для получения диагностикума на 40 определений берут 1 мл антител к РЭА рН= 7,2 7,4, добавляют 0,03 0,04 мл 2,5% водного раствора глютаральдегида и инкубируют 1 час при температуре 37^o C.

К 1 мл 8% суспензии эритроцитов добавляют 1 мл глютаризированных антител к РЭА и 20 мг бикарбоната натрия, инкубируют 2 часа при температуре 56^o C и затем еще 0,5 часа при комнатной температуре при постоянном встряхивании. Отмывают эритроциты от несвязавшихся антител 4-х кратным центрифугированием при 3000 об/мин по 4 мин. Из осадка готовят 8% взвесь в физиологическом растворе, которая и является специфическим эритроцитарным антительным диагностикумом.

Пример осуществления способа.

Реакция осуществляется в У-образных полистироловых планшета. В каждую лунку планшета вносят по 0,025 мл физиологического раствора и готовят разведения исследуемой неактивированной сыворотки крови больного, начиная с 1:2.

Во все лунки добавляют по 0,025 мл эритроцитарного диагностикума. Последняя 8-я лунка в каждом ряду служит для контроля диагностикума, т.к. в ней отсутствует антиген, содержащийся в исследуемой сыворотке. После осторожного встряхивания планшет помещают в термостат при температуре 37^o C. Результат реакции оценивают через 1,5 2 часа и проводят учет реакций по образованию "кольца" по 4-х бальной системе.

Сравнительные испытания антительных эритроцитарных диагностикумов в реакции АГА с разными концентрациями стандарта РЭА в физиологическом растворе показали, что антительный диагностикум анти-РЭА из эритроцитов кур позволяет выявить в реакции агрегатгемагглютинации в сыворотке крови человека специфический антиген до 8 нг/мл, что по чувствительности не уступает реакции агрегатгемагглютинации с диагностикумом из человеческих эритроцитов (таблица 1).

Как видно из приведенных в таблице 1 данных, во всех случаях чувствительность реакции АГА, выполненных с использованием эритроцитов кур и человека, не различаются.

Данные, приведенные в таблице 2, показывают, что: 1) титр реакции АГА зависит от концентрации РЭА в сыворотке крови, чем больше концентрация РЭА, тем больше титр положительных реакций; 2) антительный диагностикум анти-РЭА из эритроцитов кур равен по активности таковому их эритроцитов человека.

Таким образом, определение чувствительности антительных диагностикумов анти-РЭА показали, что эритроцитарный антительный диагностикум (ЭАД) из эритроцитов кур по чувствительности не уступает диагностикуму из эритроцитов человека и позволяет обнаружить РЭА в реакции АГА в концентрациях равных 8 и более нг/мл.

С целью экономии сырья (эритроцитов кур) экспериментально были подобраны минимальные концентрации эритроцитов в ЭАД, обеспечивающие получение четких результатов реакции АГА.

Из готового ЭАД, содержащего 8% взвесь эритроцитов, готовили несколько разведений (6% 5% 4% 3% 2%) и ставили реакцию АГА со стандартом РЭА (477 нг/мл). Полученные данные приведены в таблице 3.

Как видно из результатов, представленных в таблице 3, наибольшее количество положительных результатов при максимальных разведениях РЭА (1:64 - 1: 128), что соответствуют 7,5 3,8 нг/мл, зарегистрировано при использовании 4% ЭАД. В дальнейшем мы использовали для постановки реакции АГА ЭАД, содержащий 4% эритроцитов кур.

Для определения информативности реакции АГА с ЭАД из эритроцитов кур проведено исследование 25 стандартных образцов РЭА, сывороток крови 30 доноров, 30 больных с онкологическими заболеваниями и 186 больных с острыми и хроническими воспалительными заболеваниями (таблица 4).

У здоровых людей титр реакции АГА не превышал 1:4. Почти аналогичные результаты получены при обследовании больных с неонкологическими заболеваниями: у 183 из 186 человек (98,9%) из этой группы положительные реакции отмечались в титре 1:2 1:4, и только у 3 (1,1%) в титре 1:8. У больных с онкологическими заболеваниями титр реакции АГА в подавляющем большинстве случаев (86,6%) 1:8 1:64.

Таким образом, при помощи реакции АГА с ЭАД из эритроцитов кур можно выявить лиц с высоким титром реакции (т.е. высокими концентрациями РЭА) в сыворотке крови, что указывает на возможное наличие у них онкологических заболеваний и необходимость дальнейшего наблюдения у специалистов-онкологов.

На основании изложенного представляется возможным считать, что авторами предложен новый способ обнаружения РЭА в сыворотке крови обследуемых, свидетельствующего о возможном наличии у них злокачественного новообразования. Н о в и з н а предлагаемого способа заключается в том, что впервые для обнаружения РЭА использованы глютаризированные эритроциты кур, на поверхности которых адсорбированы антитела к РЭА.

Изобретательский уровень разработанного способа заключается в том, что для обнаружения РЭА использованы не применявшиеся ранее иммунологические подходы, реализованные в присоединении специфических антител против РЭА к не использованному ранее носителю эритроцитам кур.

Простота выполнения способа, доступность сырья (эритроцитов кур), безопасность лабораторных манипуляций и дешевизна применяемых реагентов позволяют использовать способ обнаружения РЭА при помощи антительного диагностикума из эритроцитов кур в широкой повседневной медицинской практике.

Использование: в области медицины, в частности в иммунологии. Сущность изобретения: смешивают пробы сыворотки крови обследуемого с диагностикумом, полученным из специфических антител к РЭА, связанных с эритроцитами крови 1 - 2-х летних кур, эритроциты которых обработаны глютаральдегидом, с последующей регистрацией агрегатгеммагглютинации антигена с антителом. Способ позволяет упростить обнаружение РАЭ и использовать его в широкой повседневной медицинской практике. 1 табл.

1 Способ обнаружения раковоэмбрионального антигена (РЭА) при помощи специального антительного диагностикума путем смешивания пробы сыворотки крови с диагностикумом, полученным из специфических антител к РЭА, связанных с эритроцитами, обработанными глютаральдегидом с последующей регистрацией реакции агрегатгеммагглютинации антигена с антителом, отличающийся тем, что в качестве диагностикума используют специфические антитела к РЭА, связанные с эритроцитами крови одно-, двухлетних кур, обработанных глютаральдегидом.