Способ диагностики хронического алкоголизма Советский патент 1993 года по МПК G01N33/50 

Изобретение относится к медицине, а именно к наркологии, и может быть использовано для диагностики хронического алкоголизма.

Известен способ диагностики хронического алкоголизма, предусматривающий определение в сыворотке крови обследуемого активности трех ферментов: гамма-глутамилт- рансферазы (ГГТ), аспартатаминотрансферазы (ACT) и аланин-аминотрансферазы (АПТ). Пол ученные значения активности этих ферментов сопоставляются с нормой, рассчитанной идентичными методами для группы практически здоровых лиц соответствующей возрастной категории. Диагноз хронический алкоголизм ставят по степени отклонения значений активности ферментов от нормы (Клинический и ферментативный методы ди- агностики алкоголизма: Методические рекомендации. М.; 1984, с. 23.).

Недостатками известного способа являются его большая продолжительность (1,5-2 ч) и необходимость повторных исследований в течение 5-10 дней, а также использование большого количества реактивов, в том

числе и импортных диагносшкумов, травма- тизация больного при трехкратном пункти- ровании вены. Кроме того, известный способ характеризуется недостаточно высокой специфичностью.

Наиболее близким техническим решением к изобретению, принятым за прототип, является способ диагностики хронического алкоголизма, предусматривающий приготовление исследуемой пробы крови, определение соотношения активности митохондрмальной ACT к общей активности ACT и сравнение полученных данных с таковыми у здоровых лиц.

Однако известный способ характеризуется недостаточно высокой чувствительностью (8.1 %) и специфичностью (82%). Кроме того, приготовление в известном способе антител к цитоплазматической ACT ведет к трудоемкости (продолжительность по времени 24 ч) и удорожанию данного способа.

Целью изобретения является ускорение, повышение чувствительности и специфичности.

ел С

1 ю VI о о

Указанная цель достигается тем, что в известном способе диагностики хронического алкоголизма, предусматривающем приготовление исследуемой пробы крови, проведение биохимического ее анализа и сопоставление результатов с нормой, из,исследуемой пробы крови выделяют эритроциты, суспензируют их в равном объеме физрастврра с последующем добавлением к ним ацетальдегида до конечной его концен- трации 100 мкм, через 1 мин производят остановку реакции, определяют выход ацетальдегида в реакционной смеси и при его значении равном и выше 30,0 мкмоль диагностируют хронический алкоголизм,

Соответствие предлагаемого решения критерию новизна доказывается тем, что при сравнении заявляемогр технического решения с прототипом выявлены его новые существенные признаки, сущность которых на дату подачи заявки не была раскрыта в СССР и за рубежом, о чем свидетельствует патентный поиск, приведенный в оправке об исследовании заявляемого объекта по патентной и научно-технической литерату- ре. Сопоставительный анализ заявляемого решения с прототипом показывает, что заявляемый способ отличается от известного тем, что к приготовленной суспензии эритроцитов, выделенных из исследуемой кро- ви, добавляют ацетальдегйд и после остановки реакции определяют выход аце- тальдегида. Анализ источников информации не выявил технических решений, порочащих новизну заявляемого объекта изобретения, что дает основание считать его соответствующим критерию новизна.

При анализе источников информации не выявлены технические решения, в которых имеются признаки, сходные с признаками, отличающими заявляемое техническое решение от прототипа. Следовательно, у заявляемого решения проявляются свойства, не совпадающие со свойствами известных решений. Это дает основание считать, что от- личительные от прототипа признаки заявляемого технического решения обеспечивают этому решению соответствующие Kpvjre- рию существенные отличия.

Благодаря наличию указанных выше отличительных признаков, а именно выделение из исследуемой пробы крови эритроцитов, сус- пензировэние их в равном объеме физраство- ра, добавление к суспензии эритроцитов ацетальдегида до конечной его концентраций 100 мкмоль; остановка реакции через 1 мин, определение выхода ацетальдегида в реакционной смеси и диагностика хронического алкоголизма при значении выхода

ацетальдегида, равном выше 30,0 мкмоль, заявляемое техническое решение обеспечивает достижение положительного эффекта - сокращение времени диагностики, повышение чувствительности и специфичности способа и его удешевление.

Способ осуществляют следующим образом..

В первые дни пребывания в стационаре у больных с подозрением на хронический алкоголизм утром натощак забирают 1 мл крови из локтевой вены в пробирки, содержащие 50 мкл 5%-н ого раствора ЭДТА для предотвращения свертывания. Плазму с лейкоцитами отделяют центрифугированием в течение 10 мин при 3000 об/мин. Оставшиеся эритроциты суспензируют в фмзраетворе и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин. Процедуру отмывания эритроцитов повторяют дважды. После последнего центрифугирования упакованные эритроциты ресуспензируют в равном объеме физраствора, Рабочий раствор в объеме 0,2 мл помещают в инсуяино- вые флаконы с плотно притертыми резиновыми пробками. После 5 мин премн- кубации на водяной бане при 37° С и посто- .янном встряхивании шприцом с тонкой мглой через резиновую пробку флакона в рабочий раствор добавляют ацетальдегид до конечной концентрации 100 мкмоль. После 1 мин инкубации реакцию связывания ацетальдегида с эритроцитами останавливают добавлением к реакционной смеси сульфосалициловой кислоты с тиомочеви- ной. Определение выхода ацетаяьдегида в реакционной смеси проводят сразу же после остановки реакции методом газовой хроматографии, 8 качестве стандарта используют раствор ацетальдегида, приготовленный на аналогичном физрастворе, в концентрации, соответствующей концентрации ацетальдегида в реакционной смеси (100 мкмоль). Выход ацетальдегида в реакционной смеси сравнивают с выходом стандарта, принимаемым за 100%, и выражают в микромолях

Аналогичным образом готовили исследуемую пробу крови здоровых лиц, из которой выделяли эритроциты,суспензировали их в равном объеме физраствора с последующим добавлением к ним ацетальдегивадо его конечной концентрации 100 мкмоль, через 1 мин останавливали реакцию и хроматог- рафически определяли выход ацетальдегида в реакционной смеси, сравнивали с выходом стандарта, принимаемым за 100%, и выражали его в микромолях. Результаты исследований при сведены в табл. 1.

.Как видно из табл. 1, сумма средней арифметической выхода ацетальдегида у здоровых лиц () и двух средних квадратичных отклонений (М+2ст ) составила 27,0 мкмоль. Данное значение является дискриминационным порогом (ДП) для определения чувствительности и специфичности способа, Диагноз хронический алкоголизм ставят по результатам сравнения значений выхода ацетальдегида больных лиц и здоровых, т.е. при значении выхода ацетальдегида, равном и выше 30,0 мкмоль диагностируют хронический алкоголизм.

В предлагаемом способе на этапе отработки оптимальных его параметров было ус- тановлено, что наилучший эффект от использования заявляемого способа регистрировался при добавлении к суспензии эритроцитов в физрастврре до конечной концентрации последнего 100 мкмоль и остановки реакции через 1 мин. При снижении концентрации ацетальдегида увеличивается погрешность анализа за счет возрастания вклада ацетальдегида, образующегося из эталона и возникает сложность в определении малых количеств ацетальдегида. При увеличении концентрации ацетальдегида погрешность анализа также возрастает за счетэнзиматического окисления ацетальдегида альдегид-дегидрогеназой эритроцитов.

При остановке реакции менее чем через 1 мин наблюдается неполное связывание ацетальдегида с эритроцитами в реакционной смеси, а при остановке реакции более, чем через одну минуту, повышение эффекта по сравнению со временем в 1 мин не наблюдается.

Пример 1. Больной Г., 41 год, поступил на стационарное лечение во 2-ое наркологическое отделение Гродненского областного наркологического диспансера с подозрением на диагноз хронический алкоголизм 28.11.88 г. Номер истории болезни 752. Давность заболевания - 5 лет. На второй день пребывания в стационаре утром натощак у больного из локтевой вены взят 1 мл крови в пробирку, содержащую 50 мкл 5%-ного раствора ЭДТА для предотвращения свертывания. Центрифугированием в течение 10 мин при 3000 об/мин отделяют плазму. Эритроциты суспензируют в двух объемах физраствора, приготовленного на 10 мМ Na-фосфатном буфере. рН 7,4 содержащем 1 мМ-ЭДТА, и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин. Такую процедуру отмывания повторяют дважды. После последнего центрифугирования 0,1 мл упакованных эритроцитов ресуспензируют в равном объеме аналогичного физраствора. 0,2 мл такой суспензии помещают в ин- сулиновый флакон с плотно притертой пробкой. После 5-минутной преинкубации на водяной бане и постоянном встряхивании 5 шприцом с тонкой иглой через резиновую пробку флакона в инкубационную смесь добавляют 10 мкл 2 мМ раствора ацетальдегида так, что конечная концентрация его составила 100 мкмоль. Для оценки выхода

0 ацетальдегида через 1 мин после начала инкубации реакцию связывания ацетальдегида с эритроцитами останавливают добавлением к реакционной смеси 0,4 мл 9,6%-ного раствора сульфосалициловой

5 кислоты, содержащей 0,29% тиомочевины. Определение выхода ацетальдегида в реакционной смеси проводят сразу же после ос- тановки реакции методом газовой хроматографии на Биохроме-1 с пламен0 но-ионизационным детектором. Температура детектора и испарителя 150° С, колонки 125 С. Термостатирование пробы при 60 С в течение 15 мин. В качестве носителя использовался полисорб 1 с диаметром гранул

5 0,25-0,5 мм. В качестве газа-носителя использовался азот. Скорость потока газа-носителя 30 мл/мин, водорода 30 мл/мин, воздуха 300 мл/мин. В качестве стандарта использовали раствор ацетальдегида, при0 готовленный на .аналогичном физрастворе, в концентрации, соответствующей концентрации ацетальдегида в реакционной смеси (100 мкмоль). Выход ацетальдегида сравнивали с выходом стандарта, принимаемым за

5 100%, и выражали в микромолях, Выход ацетальдегида по сравнению со стандартом составил 48,1 мкмоль. В нашем случае 48,1 30,0, следовательно у больного диагностируют хронический алкоголизм. Диагноз

0 хронический алкоголизм у больного Г. для достоверности был также подтвержден на основании общепринятых клинических критериев.

Пример 2. Донор М., 44 года, иссле5 дрвался 3.12.88 г. Все процедуры от забора крови до оценки выхода ацетальдегида аналогичны описанным в примере 1.

Выход ацетальдегида по сравнению со стандартом составил 24,8 мкмоль, что ниже

0 дискриминационного порога, 24,8 30,0. Следовательно, испытуемый не страдает хроническим алкоголизмом.

Предлагаемый способ диагностики применен у 23 больных с подозрением на хро5 нический алкоголизм. Результаты исследований приведены в табл. 2.

Как видно из табл. 2 (колонка 2), только у двух больных отмечается выход ацетальдегида меньше дискриминационного порога, что свидетельствует о высокой чувствительнести этого способа. Чувствительность способа составляет 91,3%. Диагноз хронический алкоголизм для достоверности у всех больных подтвержден на основании общепринятых клинических критериев. У 18 из 19 здоровых доноров (см. табл. 1) значения .выхода ацетальдегида после инкубации с эритроцитами не выходили за пределы дискриминационного порога, что свидетельствует о высокой специфичности способа. Специфичность способа составила 94,7%. .:

Предлагаемый способ позволяет диагностировать хронический алкоголизм при помощи собственной крови больного, без исследования чужеродного биологического материала, что позволяет значительно упростить процедуру исследования по сравнению с известным способом, а это ведет к

удешевлению способа (отсутствует необходимость в приготовлении специфических антител) и значительно быстрой диагностике (60-90 мин против 24 ч). Кроме того, предлагаемый способ обеспечивает по сравнению с известным повышением чувствительности (91,3 против 81 %) и специфичности (94,7 против 82%), что расширяет возможности его применения для диагностики хронического алкоголизма. Динамик изучаемого показателя (выход ацетальдегида после инкубации с эритроцитами) в процессе лечения (см. табл. 2, колонка 3) соответствует клиническим данным, демонетрирующим улучшение состояния больного, что может служить тестом за эффективностью проводимого лечения и иметь не только диагностическое, но и прогностическое значение.

:

Использование: медицина, наркология. Цель изобретения: ускорение, повышение чувствительности и специфичности способа. Сущность: осуществляют забор крови из вены больного, выделяют из нее эритроциты, суспензирование эритроцитарной массы в равном объеме физраствора с последующим добавлением к ней ацетальдегида до конечной его концентрации 100 мкмоль, остановку реакции и определение входа ацетальдегида после его 1-минутной инкубации с эритроцитами. При значении выхода ацетальдегида, равном и выше 30,0 мкмоль, диагностируют хронический алкоголизм. 2 табл.

Формула изобретения Способ диагностики хронического алкоголизма путем определения диагностического показателя в крови пациента, от л и- чаю.щийся тем, что, с целью ускорения, повышения чувствительности способа, в качестве диагностического показателя используют содержание ацетальдегида, для чего эритроциты крови пациента суспендиТа б л и ц а 1 Выход ацетальдегида после инкубации с эритроцитами здоровых испытуемых

руют в равном обьеме физиологического раствора, добавляют к полученной суспензии ацетальдегид в конечной концентрации 100 мкМ, затем через одну минуту определяют концентрацию ацетальдегида в суспензии и при его значении 30,0 мкмоль/л и выше диагностируют хронический алкоголизм.

Выход ацетальдегида после инкубации с эритроцитами больных хроническим алкоголизмом

Продолжение таблицы 1

Таблица 2