Способ выявления углеводородокисляющих микромицетов Советский патент 1993 года по МПК C12Q1/04 

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для выявления углеводоррдокисляющих микромицетов, повреждающих нефтяные топлива.

Известен способ выявления микроорганизмов-деструкторов неионогенных поверхностно-активных веществ(Г1АВ), заключающийся в приготовлении питательной,среды, содержащей минеральные соли и ионогенные ПАВ в качестве единственного источника углерода и энергии, выращивании на ней культур испытываемых микроорганизмов и определения активных форм деструкторов по зоне просветления вокруг выросших колоний, Недостатками способа являются трудоемкость и длительность анализа, а также его низкая чувствительность и достоверность.

Наиболее близким к изобретению является способ определения биодеградации нефти, по которому образцы нефти контами- нируют микроорганизмами, экспонируют в течение 7...14 сут, а затем с помощью масс- спектрометрического метода определяют содержание в них различных компонентов. Способу присущи длительность испытаний и недостаточная точность,

Цель изобретения - сокращение врёмё- ни определения и повышение точности способа.

Цель достигается тем, что в известном способе выявления углеводородокисляю- щих микромицетов, повреждающих нефтяные топлива, отбирают пробы топлива, водного отстоя из топлива или этанольного экстракта из материалов, контактирующих с жидкой фазой, и определяют в них наличие органических кислот, являющихся продуктами метаболизма углеводородокисляющих микромицетов, с помощью хроматомасс- спектроскопического метода.

В основу предлагаемого способа поло жен установленный экспериментально факт, что при наличии углеводородокисляющих микромицетов в топливе, водном отстое из топлива и этанольном экстракте из материалов, контактирующих с жидкой фазой, присутствуют органические кислоты, являющиеся продуктами метаболизма микромицетов.

Так, например, в составе образцов водного отстоя и этанольного экстракта из герметика У-ЗОМЭС-5, контактировавшего с топливом, зараженным микроскопическими

1

СО

о о о чэ

грибами родов Cladosporlum resinae (Llndau) de Vries, f. avellaneum, Penlcllllurn nalgiovensls Laxa, Acremonium Kil. Gruts, обнаружены циклогексанкарбоновая, толуи- ловая, фенилпропионовая и фенилуксусная кислоты, которые являются строго специфическими продуктами метаболизма чистых культур.

Предлагаемый способ осуществляют в следующёй Щследовательности:

отбирают пробу водного отстоя или эта- нольного экстракта;

отобранную пробу подкисляют серной кислотой до рН 2...3;

проводят экстрагирование водной фазы диэтиловым эфиром;

упаривают экстракты и обрабатывают их силилирующим агентом;

вводят пробы в испаритель хроматографа;

производят запись хроматограмм и масс-спектров исследуемых проб;

индикацию углеводородокисляющих микромицетов проводят по наличию на хро- матограммах и масс-спектрах пиков и линий, принадлежащих циклогексанкарбоновой, то- луиловой, фенилпропио.новой и фенилуксус- ной кислотам.

Данная индикация может быть проведена и по наличию других соединений, относящихся к производным циклогексана, летучим жирным: дикарбоновым. ароматическим и дикарбоновым ароматическим кислотам, однако указанные органические кислоты дают наиболее достоверный результат.

Примеры конкретного выполнения.

Хроматомасс-спектрометрический анализ.

1. Пробу водного отстоя подкисляют серной кислотой до рН 2...3. Затем к 1...2 мл водной фазы добавляют 0,5,,.1,0 мл диэтй- лового эфира и экстрагируют в течение 3...5 , мин при встряхивании. Эфирные экстракты упаривают и обрабатывают 20 мкл бистри- метилсилилтрифторацетамида (BSTFA) в течение 10...15 мин при 60...65°С.

Идентификацию состава пробы проводят методом хроматомасс-спектрометрии на хроматомасс-спектрометре НР-5985В с капиллярной колонкой из плавленого кварца, внутренняя поверхность которой покрыта неподвижной фазой - метилсиликоновая OV-101. Используют политермический режим анализа при скорости изменения температуры 3...5 град/мин. В качестве газа-носителя используют гелий, скорость потока которого составляет через инжектор 30...35 мл/мин, через колонку в масс-спектрометр 1,5...2,0 мл/мин. Запись спектров проводят непрерывно. Наличие продуктов метаболизма микромицетов в водном отстое свидетельствует о загрязнении ими топлива.

2. Пробу материала, контактировавшего с жидкой фазой, измельчают механическим способом. Навеску массой 1,0...3,0 г помещают в аппарат Сокслета, добавляют 150мл

этанола и экстрагируют в течение 6 ч. После окончания экстрагирования экстракт декантируют. Затем 1 мл этанольного экстракта упаривают и обрабатывают 20 мкл BSTFA в течение 10...15 мин при 60...65°С.

Индентификацию состава пробы этанольного экстракта проводят методом хроматомасс-спектрометрии по методике, описанной выше. Наличие продуктов метаболизма микромицетов в этанольных экстрактах материалов, контактировавших с жидкой фазой, свидетельствует о загрязнении ими топлива,

3. Идентификацию состава проб исходного и засоренного углеводородокисляю- щими микромицетами топлив проводят методом хроматомасс-спектрометрии по методике, описанной выше.

Для выделения спектров продуктов метаболизма из мешающего фона компонентов топлива используют метод компьютерной фильтрации, реализуемой с помощью ЭВМ.

Предложенный способ выявления углеводородокисляющих микромицетов, повреждающих нефтяные топлива, обладает более высокой точностью и достоверностью за счет исследования продуктов метаболизма микромицетов на молекулярном уровне. Кроме того, сокращается время выявления

углеводородокисляющих микромицетов (продолжительность определения составляет 50 мин). Формул, а изобретения

Способ выявления углеводородокисляющих микромицетов, включающий отбор пробы исследуемого материала и определение ее химического состава, о т л и ч а ю щ и- й с я тем, что, с целью сокращения времени определения и повышения точности способа, в качестве исследуемого материала используют нефтяное топливо, водный отстой из топлива или этанольный экстракт из материалов, контактирующих с жидкой фазой, непос- редственно в исследуемом материале

определяют содержание циклогексанкарбоновой кислоты, толуиловой кислоты, фенилпро- пионовой кислоты и фенилуксусной кислоты и по их наличию выявляют микромицеты класса Deitromycetes.

Использование: биотехнология, индикация биоповреждений нефтяных топлив. Сущность изобретения: для выявления угле- водородокисляющих микромицетов отбирают пробу нефтяного топлива, водного отстоя из топлива или этанольного экстракта из материалов, контактирующих с жидкой фазой, и по наличию в пробе циклогексанкарбоновой, фенилуксусной, фенилпропионовой и толуиловой кислот выявляют микромицеты класса Deltromycetes.