Способ определения гиалуронидазной активности Советский патент 1993 года по МПК C12Q1/34 

Изобретение относится к биологии, медицине, ветеринарии, и может быть использовано для определения гиалуронидазной активности в любых биологических жидкостях и средах (сыворотка, тканевая жидкость, культуральная среда и т.п.).

К настоящему времени предложено большое количество способов оценки гиалуронидазной активности. Их делят на несколько групп: .

1) Химические (сюда входят методы по определению конечных продуктов распада Тиалуроновой кислоты - М-ацетилглюкоза- мина и редуцирующих олигосахаридов);

2) физико-химические, включающие вискозиметрию, турбидиметрию, лазерную нефелометрию,

3) диффузионные и гель-электрофорез- ные, основанные на помещены гиалуроно- вой кислоты в различные виды гелей. При последующем внесении гиалуронидазы определяют зоны расщепления гиалуроновой кислоты с помощью катионных красителей типа акридина оранжевого, а также - толуи- дина синего, альцианового голубого или - в последнее время - красителя Stalnes-all ; иногда для выявления зон просветления применяют четвертичные аммониевые соединения типа цетилпиридинийхлорида, це- тилтримётиламмонийбромида и т.д.;

4) аффинные, основанные на специфическом взаимодействии с гиалуроновой кислотой гиалуронатсвязывающих бел ков (ГСБ) из протеогликанов суставов или из ЦНС (протеин гиалуронектин).

Однако До настоящего времени не существует достаточно удовлетворительного метода определения гиалуронидазной активности, который был бы специфичен, прост и чувствителен.

Все вышеперечисленные методы имеют довольно существенные недостатки:

м

со а о XI

1) химические методы специфичны, однако занимают значительное время определения (20-24 ч), в первоначальных вариантах открывали все ферменты каскада расцепления гиалуроновой кислоты (в том числе бета- глюкуронидазу и N-ацетилглюкозаминйдазу), что потребовало внесения ингибиторов последних; чувствительность методов относительно невелика;

2) физико-химические методы достаточ- но чувствительны. Тем не менее, турбиди- метрический, например, способ громоздок и сложен в исполнении, имеет узкие диапазоны пропорциональности между концентрацией гиалуроновой кислоты и мутностью. Кроме того, уменьшение мутности проб под влиянием гиалуронидазы наступает лишь при снижении молекулярного веса субстрата до 6-8 тыс.Д. Это не позволяет уловить начальные стадии деградации гиалоруно- вой кислоты (ГК). Вискозиметриче.ский метод чувствителен несколько больше турбидиметрии, однако временной интервал линейной зависимости между концентрацией фермента и вязкостью не выходит за первые 20 мин взаимодействия, метод требует строго соблюдения ряда условий - тер- мостатирования, рН, чистоты реагентов. Может быть неспецифическое падение вязкости под влиянием белков и злектролитов. Лазерная же нефелометрия требует дорогостоящего оборудования, а чувствительность ее сопоставима с вышеперечисленными методами./ ;

3) диффузионные и гель-электрофорез- ные методы весьма чувствительны, однако для достижения такой разрешающей способности (0,0003 ME) требуется удлинение инкубации до 48 ч, В методах используется дорогостоящая аппаратура, в современных модификациях применяются светочувствительные красители, что заставляет проводить сложные методы окрашивания в темноте. Помимо этого, подобные красители (типа Stairjs-al)e СССР не производят-

ся. .... ..

4) аффинные же методы до настоящего времени все еще не вышли за пределы лабораторий, в которых были изобретены , Не- обходимые гиалуронатсвязывающие белки коммерчески не производятся, требуют выделения в достаточных количествах перед постановкой реакции из протеогликанов хрящей или мозга человека. Подобное выделение, особенно из протеогликанов хряща, громоздко и трудоемко. Наконец, все эти методы основаны на иммунном (радио- или иммуноферментном определении связывания ГСБ с гиалуроновой кислотой. Принимается, что эти белки взаимодействуют с

субстратом пропорционально нерасцепленной гиалуроновой кислоте, сохранившейся после действия гиалуронидазы. Однако ранее было показано, что взаимодействие ГСБ с гиалуроновой кислотой мало зависит от длины цепи последней. Связывание может происходить одинаково с олигомерами субстрата. Данные факты ставят под сомнение вышеприведенное положение.

Далее, на определение гиалуронидазы в биологических жидкостях подобными методами значительное влияние будут оказывать другие ГСБ, в частности антитела. Они могут, взаимодействуя с гиалуроновой кислотой, блокировать сайты связывания без истинного расщепления субстрата гиалуро- нидазой и тем самым - искусственно завышать результаты, Наличие естественно встречающихся антител, связывающих ги- алуроновую кислоту, в сыворотках описано даже в норме, не говоря о сыворотках больных. В крови циркулируют также антитела к мономерам гиалуроновой кислоты, в частности, к ацетилглюкозамину. Отсюда можно .заключить, что данная весьма прогрессив- .ная группа методов также не лишена определенных недостатков.

Таким образом, все вышеизложенное свидетельствуете том, что разработка высокочувствительного и воспроизводимого метода определение гиалуронидазной активности (ГА) является по-прежнему актуальной задачей.

Базовым прототипом для предполагаемого способа является метод определения гиалуронидазной лсгйвности по предупреждению образования муцинового сгустка. . - .... ...:

Метод имеет ряд достоинств:

1) он специфичен; 2) величина сгустка пропорциональна количеству и степени расщепления ГК (гиалуроновой кислоты); 3) метод чувствителен, по крайней мере - превышает турбидиметрию, варьируя время инкубации, чувствительность можно повысить; 4) очень прост в постановке, не требует никаких дорогостоящих реагентов, специально обученного персонала и т.п.; 5) позволяет проводить определение гиалуронидазы во всех биологических жидкостях и препаратах.

Основной характер прототипа - полуколичественный характер результатов, т.е. полученные данные могут выть выражены лишь в титрах гиалуронидазы. Метод также не дает возможности точно оценить величину образующихся сгустков, что снижает его чувствительность, основан на субъективном визуальном учете.

Наконец, определение гиалуронидаз- ной активности возможно лишь при рН, близких к нейтральному, т.к. при кислом (менее 3,8-4,0) рН гиалуроновая кислота образует сгусток спонтанно до расщепления.

Целью изобретения является расширение диапазона рН определения и повышение чувствительности метода с количественным точным определением гиалуронидазы в биологических жидкостях и препаратах.

Цель достигается обнаруженной авторами способностью 2-этокси-6,9-диамино- акридина лактата (риванола) образовывать сгусток с гиалуроновой кислотой обратно пропорционально ее деполимеризации под действием фермента гиалуронидазы при расширенном диапазоне рН (2,2-8,0).

Сущность предложения заключается в определении количества хромогена (или флюорогена) риванола в образовавшемся сгустке любым кол о- или флюорометриче- ским методом.

Примеры осуществления способа.

Получение субстрата и стандартизация сгустка.

Гиалуроновую кислоту получают по из- .вестным методам. Они заключаются в следующем: пупочные канатики новорожденных собирают в достаточном количестве. Пуповины разрезают и отмывают от крови дистилли- рованной водой. Извлекают сосуды. Взвешивают полученный материал. Далее препарат отмывают трехкратно большими объемами дистиллированной воды, обсушивают на фильтровальной бумаге и измельчают до кашицеобразного состояния. При повторном взвешивании его масса увеличивается приблизительно в два раза. При необходимости субстрат доводят до двойного объема дистиллированной водой. Оставляют стоять в течение 8-10 ч на холоду при 4°С. После этого препарат нагревают до кипения и фильтруют через ватный фильтр. К полученному раствору ГК добавляют папа- ин из расчета 3,5 мг/мл. Обработку проводят в течение 1бч.при65°С. Центрифугированием отделяют полученный преципитат (30 мин, 8000 об/мин). Все полученные препараты ГК хранят в замороженном состоянии. Перед постановкой основного опыта их оттаивают и центрифугируют повторно в тех же условиях.

Концентрацию ГК оценивают по методу с карбазоловым реактивом по глюкуроно- вой кислоте, В реакциях используют препарат ГК в интервале 1-2,7 мг/мл. Оптимально - 1,5 мг/мл. При проведении реакции в этих условиях оптическая плотность образующихся контрольных сгустков обычно лежит

в пределах 0,27-0,35, что является оптимальным.

Определение стрептококковой гиалуронидазы.

5В ходе выполнения основного эксперимента к 1 объему (0,2 мл) субстрата добавляют 1 объем (0,2 мл) 0.02М фосфатного буферного раствора рН 7,0, с 0.004М ЭДТА и 0.15М NaCI, содержащего 2-кратные раз0 ведения фермента (стрептококковая гиалу- ронидаза производства НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи).

Смесь инкубируют 2 ч при температуре 37°С. По окончании инкубации в среду до5 бавляют 0,1 мл (1/4 часть объема смеси) 20%-ного раствора Тритона Х-305. Встряхивают, оставляют стоять на 5 мин при комнатной температуре. Далее на поверхность проб наслаивают 20 мкл (1/25 часть объема),

0 содержащих 200 мкг риванола. Образцы инкубируют еще 5 мин при комнатной температуре. После этого их встряхивают вторично для образования сгустка. При избыточном содержании фермента сгусток в

5 первых разведениях не образуется. Если начальный сгусток минимален, то для точного дальнейшего определения рекомендуется брать следующее разведение фермента, Та- ,кие пробы отбирают, центрифугируют при

0 1000 об/мин в течение 1 мин, надосадок сли- зают, образец однократно отмывают дистиллированной водой. Далее к нему добавляют 0,5 мл соответствующего экстрагирующего раствора и помещают в кипящую водяную баню

5 при 100°С на 5-10 мин.

При использовании очищенного препарата ГК в качестве экстрагирующего раствора применяют 1н. HCI, при применении неочищенного - смесь из 0,35 мл концент0 рированной серной кислоты и 0,25 мл раствора 1н. HCI. После этого пробы разводят дистиллированной водой до 3 мл и затем детектируют. Определение проводят либо фотоэлёктроколориметричёскй (3 свето5 фильтр, толщина рабочего слоя кюветы 0,5 см), либо - спектрофотометрически (длина волны-402 нм, толщина слоя - 1 см), либо флюорометрическй (длина волны возбуждения - 402 нм, флюоресценции - 480 нм; в

0 случае использования флюорометра БИ- АН - светофильтры с максимумами 366 и 470 нм, соответственно, объем проб доводят до 5 мл). Измерения проводят против дистиллированной воды или против раствора

5 риванола известной (12,5 мкг в пробе) концентрации при флюорометрии.

Контролем служит гиалуроновая кислота в буфер. Полученные после детекции ве- личины сравнивают с предварительно выстроенной калибровочной кривой по известной гиалуронидазе. Используется стрептококковый фермент. Его активность выражается в опытных дозах (ОД). Полученный результат должен попадать на линейный участок калибровочной кривой.

Перед учитыванием результатов необходимо оценить контроль данного эксперимента. Если он отличается от контроля при построении калибровочной кривой не более, чем на 6-7% (коэффициент вариации метода), то количество энзима можно прямо выразить в единицах гиалуронидазы. Умножая их на разведение образца, получаем количество опытных доз фермента в пробе (по стрептококковой гиалуронидазе).

В случае/если разница в контролях более значительна, то показатель оптической плотности образца умножают на отношение контролей кривой и образца, а далее сравнивают с калибровочным графиком.

При флюорометрии операции аналогичны, с той лишь разницей, что величину сгустка выражают в мкг риванола в пробе и переводят в единицы активности энзима.

Результаты определения гиалуронидаз- ной активности с различными разведения- ми фермента представлены в табл.1.

Из полученных данных видна, что линейность зависимости оптической плотности от концентрации фермента находится между 0,001 и 0,007 ОД в пробах.

Флюорометрия.

Данные, полученные при флюорометри- ческом исследовании разведении гиалуронидазы представлены в табл.2.

Полученные данные подтверждают линейный характер зависимости между концентрацией фермента и флюоресценцией в диапазоне 0,001-0,007 ОД энзима в пробах.

С целью проверки возможной чувствительности метода инкубацию удлиняли до 24 ч (спектрофотометрия, табл.3).

Из табл.3 видно, что при проведении соответствующего числа измерений можно пОЛуч ить достоверную разницу между контролем и, например, 2-й пробой, что позволяет открыть менее 0,0001 ОД фермента в пробе. Используя эти данные, был подсчитан также коэффициент корреляции г между количеством гиалуронидазы в пробах и оптической плотностью Е. Он оказался равен 0,97.

При исследовании способа на воспроизводимость получены следующие данные (см. табл.4). Прй йз учении же воспроизводимости контролей К вар, состави л 6,09%.

Данные; подтверждающие возможность применения метода при различных

рН (по крайней мере - от 2,2 до 8,0) приведены в табл.5.

Максимальная активность фермента была обнаружена в Na-фосфатном буфере,

рН7,0,.

Определение сывороточной гиалуронидазы.. . .

В ходе выполнения основного эксперимента к 1 объему (0.2 мл) субстрата добавля0 ют 1 объем (0,2 мл) 0.02М ацетатного буферного раствора рН 3,8, с 0,004М ЭДТА иО,15М NaCI, содержащего сыворотку больных или здоровых лиц, предварительно разведенную в 1000 раз на буфере.

5 Смесь инкубируют 2 ч при температуре 37°С. По окончании инкубации в среду добавляют 0,1 мл (1/4 часть объема смеси) 20%-ного раствора Тритона Х-305. Встряхивают, оставляют стоять на 5 мин при комнат0.ной температуре. Далее на поверхность проб наслаивают 20 мкл (1 /25 часть объема), содержащих 200 мкг риванола. Образцы инкубируют еще 5 мин при комнатной температуре. После этого их встряхивают

5 вторично для образования сгустка. Пробы центрифугируют при 1000 об/мин в течение 1 мин, надосадок сливают, образец однократно отмывают дистиллированной водой, Далее к нему добавляют 0,5 мл соответству0 ющего экстрагирующего раствора и помещают в кипящую водяную баню при 100°С .на 5-10 мин.

При использовании очищенного препарата ГК в качестве экстрагирующего раство5 ра применяют 1н.НС1.

После этого пробы разводят дистиллированной водой до 3 мл и затем детектируют. Определение проводят либо фотоэлектроколо- риметрическй (3 светофильтр, толщина рабо0 чего слоя кюветы 0,5 см), либо - спектрофотометрически (длина волны - 402 нм, толщина слоя - 1 см), либо флюорометри- чески (длина волны возбуждения - 402 нм, флюоресценции - 480 нм; в случае исполь5 зования флюорометра БИАН - светофильтры с максимумами 365 и 470 нм, соответственно, объем проб доводится до 5 мл). Измерения проводят против дистиллированной воды или против раствора ривано0 ла известной (12,5 мкг в пробе) концентрации при флюорометрии.

Полученные после детекции величины сравнивают в предварительно выстроенной калибровочной кривой по стрептококковой

5 гиалуронидазе.

Результаты обследования 12 здоровых доноров (1-12), 3 больных (1. II, III - соответственно - ревматоидный артрит, рак печени, системная красная волчанка) представлены в табл.6.

2 контроля - буферный раствор, 1 - прогретая до 100°С, разведенная 1/1000 сыворотка больного ревматоидным артритом.

Из табл.6 следует, что уровень гиалуро- нидазы в сыворотках здоровых доноров составляет 0,139 ± 0,0032, больных - 0,0636 0,08 ед. оптической плотности (р 0,05). В среднем уровень гиалуронидазной активности при патологии выше, чем в норме. Пересчет на содержание фермента в 1 мл пробы проводят, как описано выше.

Наконец, прогревание пробы до 100°С практически полностью ингибирует гиалу- ронидазную активность (см. контроли в табл.6).

Определение гиалуронидазной активности в иммуноглобулинах. : В реакции применяют папаинизирован- ный препарат ГК.

В ходе выполнения основного эксперимента к 1 объему (0,2 мл) субстрата добавляют 1 объем (0,2 мл) 0.02М фосфатного буферного раствора рН 7,0, с 0.004М ЭДТА и 0.15М NaCI, содержащего иммуноглобили- ны в концентрации 2 мг/мл. Все пробы и контроль (гиалуроновая кислота и буфер) ставили в триплетах.

Смесь инкубируют 24 ч при температуре 37°С. Для предотвращения микробной контаминации в среду добавляют азид Ма до конечной 0,25%-ной концентрации. По окончании инкубации в смесь вносят 0,1 мл (1 /4 часть объема смеси) 20%-ного раствора Тритона Х-305. Встряхивают, оставляют стоять на 5 мин при комнатной температуре. Далее на поверхность проб наслаивают 20 мкл (1/25 часть объема), содержащих 250 мкг риванола. Образцы инкубируют еще 5 мин при комнатной температуре. После этого их встряхивают вторично для образования сгустка. Пробы центрифугируют при 1000 об/мин в течение 1 мин, надосадок сливают, образцы однократно отмывают дистиллированной водой. Далее к ним добавляют 0,5 мл 1 н HCI и помещают в кипящую водяную баню при 100°С на 5-10 мин.

После этого пробы разводят дистиллированной водой до 3 мл и затем детектируют. Определение проводят либо фотоэлектроколориметрически (3 светофильтр, толщина рабочего слоя кюветы 0,5 см), либо - спектрофотометрически (длина волны - 402 нм, толщина слоя;- 1 см), либо флюорометричёски (длина волны возбуждения - 402 нм, флюоресценции - 480 нм; в случае использования флюорометра БИ- АН - светофильтры с максимумами 365 и 470 нм, соответственно, объем проб доводят до 5 мл). Измерения проводят против дистиллированной воды или против раствора риванола известной (12,5 мкг в пробе) концентраций при флюорометрии.

Полученные после детекции величины

сравнивают с предварительно выстроенной

калибровочной кривой по стрептококковой

гиалуронидазе при инкубации в течение 24 ч.

Результаты представлены в табл.7.

Из табл.7 следует, что иммуноглобулины больного с ревматоидным артритом достоверно (р 0,001) усиливают расщепление гиалуроновой кислоты по сравнению со здоровыми лицами и со спонтанным гидролизом субстрата. Построение калибровочной

кривой в течение 24 ч (по стрептококковой гиалуронидазе) позволяет количественно оценить гиалуронидазную активность антител (см. табл.3). Она соответствует приблизительно 0,0005 ОД в 0,1 мл препарата

иммуноглобулинов.

Данное приложение способа представляется важным, поскольку энзимоподобное действие иммуноглобулинов является в последнее время предметом повышенного интереса исследователей,

Определение гйалуронйдазнЬй активности в микробных культурах.

С целью определения гиалуронидазной активности микробных клеток применяли

следующую модификацию метода: суточные культуры микроорганизмов выращивали на плотных питательных средах. 1-2 петли материала суспендировали в физиологическом растворе. Мутность взвеси оценивали

по поглощению при 600 нм на СФ-26. При необходимости ее доводили до 0,2 физиологическим раствором.

0,1 мл суспензии микробных тел, 0,1 мл физиологического раствора смешивали с 0,2

мл гиалуроновой кислоты (конечная концентрация - 1 мг/мл). Время инкубации 2ч. Предварительные эксперименты показали, что при выраженной гизлуронидазной активности Kynbtyp сгусток в опыте не образуется.

Поэтому в дальнейших экспериментах осуществляли 5-кратные разведения исходной взвеси. Результат определения гиалуронидазной активности некоторых штаммов

золотистых стафилококков представлен в табл.8 (спектрофотометрия).

Сопоставление чувствительности предлагаемого метода с используемыми в настоящее время.

А. Турбидиметрия.

Исследование проводили по известному методу/Время инкубации 2 ч, при температуре 37°С. Условия эксперимента (рН, ионная сила) соответствовали предлагаемому методу.

При оценке результатов данного опыта выяснилось, что за 2 ч в турбидиметрии открывается лишь от 0,1 до 0,01 ОД фермента в пробе, что по меньшей мере в 20 раз ниже чувствительности предлагаемого способа.

В. Вискозиметрия..

Вискозиметрию проводили в вискозиметре Оствальда с временем протекания контрольного буфера 6,67 с.

Соотношения реагентов в данном эксперименте по-прежнему соответствовали данному методу. ;7

Вискозиметрически за 2ч открывалось не более 0,015-0,02 ОД фермента, что также уступает в чувствительности нашему методу приблизительно йа порядок.

С. Метод муЦийового Сгустка.

Постановку метода муциноёого сгустка проводили по известным рекомендациям. Дополнение к условиям заключалось в том, что реакцию проводили на Na-фосфатном буфере рЙ 7.0 (как и в данном способе).

8 результате оказалось, что муцйновый сгусток достбверйо открывает не более 0,02 ОД гйалуронидазы в пробе за 2 ч. Это в 20 раз ниже чувствительности предлагаемого

спосбба. ...j: .- -v -; I -.-- J ti. Определение гйалуронидазы по концевому -ацётйлглюказамину.

Оптймалцйыё условия для стрептококковой гйалуронидазы сбответствбвалй предлагаемому MetoAy.

Сравниваемый Metofl открывал за 2 ч 0,005-0,01 ОД гиалуронидазы; что в 5-10 раз уступает по чувствительности предлагаемому способу;

Подытоживая вь1Ш/ёизлЬжейй6ё, следует отметить, что предлагаемый метод в 5-20 раз чувствительнее наиболее широко применяемых способов детекции гиалурони- дазной активности.:

Эффективность метода.

Эффективность способа заключается в том. что он позволяет пбвысить чувствительность метода, по сравнению с прототипом в 10 раз, расширяет диапазон рН определения ферментативной активности гиалуронидазы, дает возможностьТочной количественной оценки содержания фермента.

Метод пригоден для массовых исследований.

Ф о р м у л а и з о б р ет е н и я

1. Способ Определения гиалуронидаз- ной активности, включающий инкубацию

испытуемого образца, содержащего фермент с гиалуроновой кислотой, введение в полученную смесь сгусткообразователя и учет результатов, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью расширения диапазона рН определения и повышения чувствительности способа, в качестве сгусткообразователя используют 0.75-1.25%-ный раствор риванола, который добавляют к смеси в соотношении 1:25, после образования сгустка из негр экстрагируют риванол 1Н раствором соляной кислоты или смесью равных объемов 1н. раствора соляной и концентрированной серной кислоты на кипящей водяной бане в течение 5-10 мин, затем в

экстракте определяют концентрацию рива- йола путем измерения оптической плотности экстракта колориметрическим методом при длине волны 402 нм или флюоресцей- ции экстракта при длине волны возбуждейия 402 нм и эмиссии 480 нм и по его концентрации определяют активность гиа- луронидаэы,

2. Способ по п.1, о т л и ч а Ю щ и и с я тем, что перед введением риванола в смесь добавляют 20% тритон Х-305 или Х-100 в соотношении 4:1 и инкубируют 5 мин.

Использование: биология, медицина, ветеринария. Сущность изобретения: суб- страт-гиалуроновую кислоту, инкубируют с испытуемым образцом, содержащим фермент. Вносят сгусткообразователь - 0,75- 1,25%-ный раствор риванола. Из полученного сгустка экстрагируют риванол 1н. раствором соляной кислоты или смесью равных обьемов 1н. раствора соляной или концентрированной серной кислоты на кипящей водяной бане в течение 5-10 мин. В экстракте определяют концентрацию риванола измерением оптической плотности колориметрическим методом при длине волны 402 нм или флюоресценции при длине волны возбуждения 402 нм и эмиссии -480 нм. По концентрации риванола определяют активность гиалуро- нидазы. Перед введением риванола в смесь добавляют тритон Х-305 или Х-100 в соотношении 4:1 и инкубируют 5 мин. Возможна точная количественная оценка содержания фермента в пробе в диапазоне рН от 2,2 до 8,0 с субстратом различной степени очи- щенности. 1 з.п. ф-лы, 8 табл.

Результаты определения гиалуронидазной активности с различными разведениями энзима (СФ-метрия). :

Примечание: С-( концентрация фермента в пробах в опытных дозах )/1000; Е- оптическая плотность образцов, Е контролей - 0,27 и 0,276.

Таблица

Флюорометрическое определение гиалуронидазы

Примечание:определение проводили на спектрофлюориметре Hitachi, флюоресцентный контроль (12,5 мкг риванола в пробе) постоянен - 50 мкА.

Зависимость между концентрацией стрептококкового энзима и оптической плотностью при инкубации в течение 24 ч в Na-фосфатном буфере.

Примечание: С - концентрация стрептококковой гиалуронизады.ОД в пробе/10000;

значение контрольных проб - 0,315, 0,294 и 0,304.

Таблица4

Воспроизводимость метода в опыте ( 0,003 ОД фермента в пробе ) по данным спектроф- люориметрии.

Примечание: флюоресцентный котроль постоянен и равен 50 мкА.

,. Т а б л и ц а 5

Зависимость активности стрептококковой гиалуронидазы от природы использованных буферов (СФ - метрия )

Таблица2

ТаблицаЗ

Сыворрчнзя гиалуронидазная активность в норме и при патологии.

Гиалуронидазная активность антител здоровых лиц и больных рзвматоидным артритом,

Примечание: экстинкция контроля без антител: Е- 0,300, 0,305, 0,28.

Примечание: Е ср, контролем -0,325.

Таблицаб

Таблица

Таблицаб