Способ определения таксономической принадлежности кальмаров Советский патент 1985 года по МПК A01K61/00 

1

Изобретение относится к зоологии и морскому промыслу, а точнее к рациональному рыболовству и воспроизводству вида, в частности к уточнению систематики,малюсков с помощью биохимии.

Известны биохимические методы уточнения таксономии, например серологический метод 1Г1 3, основанный на связывании антигенных белков с антителами, и геносистематичес1Шй L, основанный на изучении свойств отдельных генопродуктов - последовательности аминокислотных остатков в белках и нуклеотидах в РНК.

Недостатками указанных способов являются длительность и сложность (Определения таксона о

Наиболее близок к предлагаемому по технической сущности энзимологический метод 3 , использующий для уточнения систематики субстратную специфичность ферментов. Согласно этому в качестве сравниваемого биохимического признака изучается субстратная специфичность ферментов класса гидролаз, действующих на сложные эфирные связи (КФ 3.1), и сопоставляются кинетические параметры энзиматического гидролиза. Кроме то го, предусмотрено использование возможности взаимодействия высокоспецифических субстратов с фосфатазой (КБ 3.1.3.2) и холиэнэстеразой (KB 3.1.1.7), т.е. с такими фермен,тами, каталитические свойства которых не изменяются в процессе равития особи (так называемые конститутивные ферменты).

Недостатками известного метода являются относительная сложность и некоторая длительность так как для построения кривых гидролиза субстратной специфичности необходимо измерять активность (скорость) не при одной высокой, а при малых, срених и больших величинах концентраций (5-10 тоуек) субстрата, что в свою очередь, требует большого расхда реактивов. Кроме того, большое количество измерений и вычислений несколько снижает точность и воспроизводимость метода.

Цель изобретения - повышение чувствительности и упрощение способаi

Поставленная цель достигается тем, что после определения скорости гидролиза при одной концентрации

420792

субстрата в реакционную среду вводят ингибитор, инкубируют и определяют остат,очную активность конструктивных ферментов при той же концентрации

5 субстрата, причем для определения таксономической принадлежности кальмара используют бимолекулярную константу скорости ингибирования.

Предлагаемый метод уточнения таксономии предусматривает взаимодействие высокоспецифичных ингибиторов с фосфатазой (КФ 3.1.3.2) и холинэстеразой (КФ 3.1.1.7).

Высокая специфичность предопрёде)5 ляет прежде всего самый минимальный расход ингибиторов, так как их ингибирующая деятельность на активность ферментор проявляется при очень низких концентрациях ( и ниже).

0 Более того, для уточнения таксономической близости особей необходимо произвести только два измерения: измерение начальной активности Vg (без ингибитора); измерение остаточной активности фермента после ингибирования V.. Высокая чувствительность ингибитора, т.е. действие его в очень низких концентрациях, является основой высокой воспроизводимости метода.

I;

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом.

Готовят гомогенат соответствующей ткани для исследования: гомогенат оптических ганглиев кальмаров для определения свойств холинзстераз и фосфатаз или их гонад для изучения свойств фосфатаз. Готовят растворы соответствующих субстратов для каждого из ферментов: холиновые эфиры уксусной, пропионовой, масляной и т.д. кислот для холинэстераз;. фосфорные эфиры ортофосфорной кислоты для Tj)ocфатаз. Определяют начальную скорость гидролиза V- этих субстратов

под действием ферментов и скорость гидролиза V этих субстратов после взаимодействия фермента с ингибитором в течение 2 мин. Рассчитывают бимолекулярную константу взаимодействия фермента с ингибитором К,-. Путем сравнения полученных данных, определяющих биохимический признак особи, . уточняется таксономический ранг 5 особи.

Гомогенаты тканей имеют различную концентрацию - от самой большой 100 мг/мл при низкой активности в ткани до самой низкой 10 мг/мл при высокой активности. Наиболее важным для данлой стадии является приготовление при помощи гомогенизатора тонкодисперсной равномерной в.звеси. Раствор соответствующих субстратов готовят в любой концентрации (в пределах от ЫО- до ЫО- М), например 1-10-2 м приэтой концентрации измеряют как V, так и V. Метод определения холинэстеразной активности (скорости гидролиза VQ) основан на потенциометрическом титро вании щелочью кислот, образующихся в ходе ферментативного гидролиза суб стратов: уксусной - из ацетилхолина пропионовой из пропионилхолина, масляной из бутирилхолина и т.д. Метод определения фосфатазной активности основан на измерении образу ющихся при ферментативном гидролизе зфиров ортофосфорной кислоты фосфатов, которые при взаимодействии с молибдатом аммония образзпот соли ге терополикислот, восстанавливающихся амидолом до молибденовой сини. На основе полученных данных К jj рассчитывают по формуле: - 2.3 ff 2,В опытное V Cl контроле Бимолекулярная константа К г, является характерным биохимическим при знаком особи. Предлагае1Уб1й метод позволяет определять более низкий токсономический ранг, вплоть до подвида, кроме того, упрощается способ определения и сокращается время получения ре/ зультатов анализа в св.язи с тем, чт во-первых, измерение проводится тол ко при одной высокой концентрации субстрата, во-вторых, для вычисления величины Kjj не требуется вычисления величины V, поскольку в «гвязи с тем,, что она входит как в числитель, так и в знаменатель формулы, можно подставить.значения скорости реакции, измеренные в секундах, как для контроля (f контроль) так и для опыта после ингибирования С опытное Для способа также характерны высокая воспроизводимость результатов, так как значительно сокращены длительно ти подготовки эксперимента, приготовление лищь одной выбранной концентрации раствора субстрата, определенной концентрации ингибиторов, соли, гомогената фермента. Обработка результатов состоит лишь в определении КJ. Метод обеспечивает повышение точности определения, так как свойства изучают при одновременной реакции высокоспецифичных субстратов и высокоизбирательных ингибиторов. Пример 1. Уточнение таксономии с помощью фосфатазы ганглиев. Активность фосфатазы определяли по модифицированному методу Боданского, согласно которому образующиеся при гидролизе эфиров ортофосфорной кислоты фосфаты при взаимодействии с молибдатом аммония образуют соли гетерополикислот, восстанавливающиеся амидолом до молибденовой сини, обладаюлтай ярко-синей окраской с максимумом поглощения в зоне 750 нм. Оптическую плотность молибденовой сини определяли с помощью фотоэлектроколориметра ФЭК-60, светофильтр № 7 или с помощью i спектрофотометра СФ-26 при- длине волны 750 нм. Калибровочную кривите строили, используя в качестве источника фосфата водный раствор КН РО. Исходный раствор содержал в 1 МП 50 мкг Р. Количество фосфата в пробе изменяли от 2,5 до 4,5 мкг. За единицу активности принято такое количество фермента, которое образует при гидролизе соответствующего субстрата за 1 ч при 30 1 мкмоль Р. Ткань гомогенизировали в 9 объемах 0,1 М хлористого калия; конечная концентрация ткани с 100 мг/мл. Активность определяли при рН 3,5, которое поддерживали буфером 0,2 М глицин - 0,2 МНС I, содержащимсдля стабилизации фермента 140- М раствор хлористого магния. В качестве с субстрата использовали алифатический эфир ортофосфорнойдкислоты oi-глицерофосфат. Исходный раствор субстрата - оСглицерофосфата () готовили на воде (с последующим доведением рН раствора до, соответствующего для опыта значения 0,2 М раствором HCf). Для каждого опыта готовили 3 пробы: первая (первый контроль) служит контролем на самопроизводный (спонтанный) гидролиз используемого субстрата - к 0,5 мл буфера добавляли 0,5 мл воды; вторая (вторичный контроль) является контролем на содержа ние фосфора в исходной ткани - к , 0,5 мл буфера добавляли 0,5 мл Н,0 и 0,5 мл гомогената, третья (рабочая) - к 0,5 мл буфера добавляли 0,5 мл гомогената. Активность измер ли при концентрации субстрата З-Ю Пробы инкубировали 15 мин при 30 в термостате, а затем через равные промежутки времени (1 мин) в первый контроль и рабочую пробу добавляли 0,5 мл субстрата, предварительно на гретого до 30, и инкубировали далее все три пробыв течение 2 ч,после чего реакцию останавливали введением каждую пробу последовательно по 0,5 мл 30%-ной трихлоруксусной -кисл ты через те же промежутки времени (1 мин). Смесь центрифугировали на настольной центрифуге ЦУМ-2 при комнатной температуре в течение 15 мин при п 5000 об/мин, после чего к 0,5 MJt надосадочной жидкости добавля ли 3,5 мл воды и 0,6 мл 2,5%-ного раствора молибдата аммония в 6 н. HgSOj, и 0,4 мл 0,5%-ного раствора амидола в 5%-ном padTBope , Амидол. добавляли в каждзто пробу через равные промежутки времени(1 мин) с тем, чтобы через это же -время после инкубации в течение 20 мин измерять оптическую плотность. Начальную скорость тидролиза V рассчитывали по формуле: . 4содержание Р мк-моль Р о 27575731 ч7мл где . 4 - число,- которое показьшает какую часть от общей сме си брали на фотометрирование после центрифугировании (0,5 мл из 2 мл смеси); содержание Р . , -- количество фосфора неорганического, мк моль, образующе гося в процессе .ферментативной реакций (рабочая про ба) за вычетом сум мы количества Р первого и второго контроля; 2 - время инкубации,ч 0,5 - количество внесенного гомогената,мл. При работе с ингибитором - диизопропилфторфосфатом (ДФФ) при концентрации 810- М в первую пробу к 0,5 мл буфера добавляли 0,5 мл воды и 0,2 мл ингибитора; во вторую пробу к 0,5 мл буфера 0,3 мл воды; 0,5 мл гомогената и 0,2 мл ингибитоpa,i в третью к 0,5 мл буфера 0,5 мл гомогената и 0,2 мл ингибитора. После инкубации в течение 15 мин через равные промежутки времени в первую пробу (первый контроль) .и в третью пробу (рабочую) добавляли 0,3 14Л субстрата. Дальнейшая методика работы осталась прежней. Скорость гидролиза V. рассчитывали аналогично Vg, причем содержание Р - это количество неорганического фосфора (мк..моль), образовавшегося в процессе ферментативной реакции после взаимодействия ингибитора с ферментом. Бимолекуляруют константу К| рассчитывали по формуле: К. 2,3 ,18 1, V де 2,3 - коэффициент перехода от натурального логарифма к десятичному; t - время инкубации (взаимоде г.твие ингибитора с ферментом, мин); l - концентрация ингибитора, при которой наступает 50%-ное торможение, М; Vj - начальная скорость гидролиза;V, - скорость, гидролиза после взаимодействия ингибитора с ферментом. Бимолекулярная константа скорости К ингибирования активности фосфатазы ганглиев командорского и ново лан;;1ского кальмаров приведана в табл. 1« Таблица ид кальмара омандорский Berryteutis magister3,4 -10 Новозеландский Nototodarus sloani si0,7-103 Примечание. Субстрат (.-глицерофосфат, ингибитор ДФФ. П р и м е р 2. Уточнение таксономии с помощью фосфатазы гонад, СубстратнуЛ) специфично-гJ фосфатазы гонад определяли аналогично примеру 1. Бимолекулярная константа скорости К,- ингибирования активности фосфатазы гонад командорского и новозеландского кальмаров приведена в табл. 2. . Таблица2 Командорский Berryteuthis 3,1.-103 magistei Новозеландский Nototoda1,4,-10 rus sloani si Примечание. Субстрат фенилфосфат, ингибитор ДФФП р и м е р 3. Уточнение токсоно мии кальмаров кинетико-энзимологическим методом путем изучения ингибиторной специфичности холинэстеразы оптических ганглиев Ommostrephes bartrami семейства Ommastrephidae. Холинэстеразную активность опр деляли методом потенциометрическог титрования (Яковлев, 1965) при рН 7,7 щелочью кислот, образующихся п ферментативном гидролизе следующих холиновых эфиров (субстратов): иод ды ацетилхолина .(АХТ-СНзС(0)ОСН2СН2Й(СН)з , бутирилхолина (БуХ)-СНдСН2СН2С(0)ОСН2СН2Ы(СНз)д , бромид ацетил-р-метилхолина (МеХ) -СНзС(0)ОСН(СН)СН2Н(СНз)2 . Активность фермента при отсутств ингибитора определяли в единицах на чальной скорости Vg, для чего в сте лянную (t 25°), подключенную к термостату термостатируемую кювету вносили последовательно 1 мл 7.-10 фосфатного буферного раствора с рН 7,7.; 0,2 мл гомогената ткани оптиче кого ганглия; 1 мл 1 М раствора хлористого калия; определенное количество дистиллированной воды до общего объема пробы 10 мл с учетом добав ляемого в последнюю очередь объема субстрата. Смесь перемешивали магнит ной мешалкой, проверяли рН реакционной смеси (не ниже 7,7), после чего вносили субстрат, количество которого рассчитьшали таким образом, чтобы его конечная концентрация была равна принятой для опыта. Образующую-, ся в ходе ферментативного гидролиза карбоновую кислоту определяли титрованным раствором щелочи, которую добавляли из откалиброванной (1 см 46 мкм) бюретки небольшими порциями с таким расчетом, чтобы отклонения стрелки на шкале не превышали 7,.5+ ±0,1 рН. Контроль рН осуществляли при помощи стеклянного и хлорсеребря.ного электродов и проточного электрода сравнения, подключенных к высокочувствительному потенциометру типа рН 262, рН 673, рН 340. Величину активности фермента в единицах начальной скорости реакции рассчитывали по формуле V -iJl- tLi. где Nyj- нормальность раствора щелочи, мкмоль/мл; количество раствора щелочи, затраченной на титрование, . мл; t - продолжительность титрова- . ния, мин. Активность фермента в присутствии ингибитора определяли в единицах скорости реакции (V), для чего в стеклянную термостатируемую кювету вносили последовательно 1 мл 7 фосфатный буферный раствор с рН 7,7; 0,2 мл гомогената ткани оптического ганглия; 1 мл 1 М раствора хлористодистиллированной воды до общего объема пробы 10 мл с учетом добавляемого в .последнюю очередь объема субстрата; смесь перемешивали магнитной мешалкой, проверяли рН реакционной смеси (не ниже 7,6),. затем вносили фосфорорганический ингибитор, объем раствора которого подбирали экспериментально таким образом, чтобы-его конечная концентрация в робе без субстрата вызывала точно 50%-ное снижение V Q за строго определенное и измеряемое секундомером время инкубации (например, 2 мин) фермента с ФОН. Субстрат вносили в тот момент, когда время инкубации быпо равно заданному для опыта. Количество субстрата должно быть равным количеству субстрата в контрольном опыте (по определению V или Е,) . Образующуюся в ходе ферментативной реакции карбоновую кислоту определяли титрованием щелочью как и в контрольном опыте. Величину остаточной активности фермента в единицах скорости реакции или рассчитывали по формуле V . или измеряли в секундах опытное время образования такого количества карбоновой кислоты : холинового эфира после взаимодействия фермента с ФОН, которое оттитровывается одним сантиметром микробюреткй. Бимолекулярную константу (Кд) ско.рости взаимодействия фермента с ФОН рассчитьшали по формуле (Яковлев, 1965) для Kjj псевдомономолекулярной реакции: Vo 3 , oп 2 ±i le tci -ffc t Cl V, -f, - скорость холинэстеразгде V,. и ного гидролиза субстра TOB без добавления ФОИ соответственно мк моль/мин и с; V и fj, - скорость .холинэстераз- ного гидролиза субстра тов после инкубации фермента с ФОИ соответственно мк моль/мин и с; I - концентрация ингибитора в пробе, М; t - время инкубации фермен та с ФОН, мин. В качестве специфических ингибиторов использовали следующие фосфорорганические соединения: Диизопропил- Q фторфосфат(ДФФ) -4CH.j)2CHO (СНр СНОF 45 Сульфометилат-0-этш1-3-(2-этилметилсульфоний этил)-метилтиофосфата (общесоюзный шифр Гд-42) 2 ;° °S-CH,-CH, г vnj о-н.Бутил-S-(2-этилмеркаптоэтил)метилтиофосфонат (общесоюзный шифр ГА-59) / PV s-CH,-CH-5-CjHj 5 0-Этил-5-(3-метш1бутил)-метил- иофосфонат (общесоюзный шифр ЛГ-62) 5- СН,-СН.-СН о -(1-Метил-2,2-диметилпропил)-S(2-этилмеркаптоэтш1 метилтиофосфонат (общесоюзный шифр ГА-102) // , (CHjjc-cH-0-p -S-PH-CH -S-C H, В качестве примера приведены данные по кальмару Omnastrephes bartrami из четырех частей ареала: Южной Атлантики, Большого Австралийского залива (БАЗ) юга Тихого океана. Се- : верной Атлантики и северо-западной части Тихого океана. Морфологические различия между северо- и южноатлатическими особями невелики и обнаружены в относительных размерах сперматофороэ,а также в с составе паразитофауны.Однако они отно- , сятся к числу безразличных признаков и таксономического значения неимеют. начальном этапе работ было показано очень важное свойство К,7, а именно: величина К,- для холинэстеразы не зависит отфизиологического состояния ocofc::: ни от пола, ни от стадии зрелости, так как сравнение R. всех групп образцов кальмара одного ареала (самок и самцов, I-IV стадий зрелости) не дало достоверных различий с вероятностью р 75%. Эти факты свидетельствуют в пользу конститутивности фермента (Ленинджер, 1975) и позволяют использовать величину Кг( как биохимический признак сходства и различия особей. Аналогичным образом было показано. q,j,Q величина K|j холйнэстеразы оптических ганглиев кальмаров Бартрама из Южной Атлантики и БАЗ юга Тихого океана не имеют различий в К,-; с вероятностью р 75%, что позволяет сделать заключение о единой южной форме кальмаров данного вида O.bartrami. Видимо, кальмары с течением проникают из Южной Атлантики в Индийский океан, а затем в БАЗ юга Тихого океана, который может служить местом нагула особей. По мере роста и созревания кальмары вновь возвращаются в Индийский океан для размножения.

, Так как величины К (кальмаров Юга Атлантики и БАЗюга Ти

кого океана тождественны,в табл.3 Бимолекулярные константы органических ингибиторов ров Бартрама

они приведены в единой графе под названием Южные формы. (Кц) М мйн скорости взаимодействия фосфорс холинэстераЗОЙ оптических ганглиев кальмаиз различных частей ареала ТаблицаЗ

1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТАКСОНОМИЧЕСКОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ КАЛЬМАРОВ по морфологии и каталитическим свойствам конститутивных ферментов гомогенатов тканей кальмаров, определяемым по кинетическим параметрам скорости гидролиза субстрата ферментами, отличающийся тем, что, с целью повьшения чувствительности и упрощения, после определения скорости гидролиза одной концентрации субстрата в реакционную среду вводят ингибитор, инкубируют и опре- деляют остаточную активность конститутивных ферментов при той же концентрации субстрата, причем для определения таксономической принадлежности СЛ кальмара используют бимолекулярную константу ингибирования. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве конститутивных ферментов используют фосфотазу и холинэстеразу.

Сравнение величины Kg для кальмаров четырех частей ареала, определен,ной по пяти ингибиторам и трем субстратам, показало, что уже один ингиби-50 тор ДФФ дает очень большие различия. Так например, по АХ К,7 для южных форм намного вьше (в 2,3 раза) К,-; для Севера Атлантики и еще вьше (в 10 раз) К,7 северо-западной части Тихого океа- 53 на. Таким образом, налицо явное биохимическое различие всех трех форм кальмаров, .

Как показывают критерии различия (табл. 4) другие ингибиторы, например ЛГ-62 и ГА-59, также дают различные величины Kj для хсшинэстераз кальмаров разныхформ (для Южной и Северной Атлантики с ГА-59 по бутирилхолину и с ЛГ-62 по ацетилхолину; для Южных форм и северо-западной части Тихого океана с ЛГ-62 по бутирилхо1лину; для северо-западной части Тихого океана и Северной Атлантики с ЛГ-62 и ГА-59 по бутирилхолину). Критерии различия при ганглиев кальмаров сравнении холинэстеразы ткани оптических трех различных районов ареала Т а б л и ц а 4