Способ иммунодиагностики инфекции Советский патент 1993 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для иммунодиагностики инфекций,

, Известен способ иммунодиагностики путем одновременного определения фагоцитарной активности лейкоцитов (ФАЛ) крови больного и контрольных лиц с использованием в качестве объектов фагоцитоза эритроцитов из специфического и неспецифического, эритроцитарных диагностику- мов. По этому способу исследуют ФАЛ со смесью специфических и неспецифических объектов фагоцитоза и производят сопряженныйi учет фагоцитоза обоих объектов. Специфические изменения ФАЛ больного определяют по соотношению уроёней специфического и неспецифического объектов в сопоставлений с их соотношением у контрольных лиц. Достоверным считают сдвиг величины соотношения более 1,50 или менее 0,66.:

Недостаток указанного способа заключается в необходимости проведения дополнительного исследования у контрольных лиц и в недостаточной точности, связанной с тем, что в качестве контрольных лиц используются здоровые лица с разными уровнями ФАЛ, что определяет возможность дополнительной погрешности исследования фагоцитоза. В частности, при низком абсолютном уровне ФАЛ у контрольных лиц погрешность метода возрастает. Вследствие этого невозможно достоверно определить специфический сдвиг соотношения фагоцитоза при изменении величины соотношения фагоцитоза двух объектов меньше,

ч

ч ю VI

чем в 1,5 раза в сравнении с контролем (индекс меньше 0,67 или более 1,5 раза). Кроме того, у больного возможны различные изменения крови, что ведет к различному окрашиванию мазка крови у больных и контрольных лиц. У больного и контрольных лиц должна быть одинаковая экспозиция крови с объектами фагоцитоза и модуляции времени не допустимы.

Цель изобретения - повышение точности и уменьшение трудоемкости способа.

Указанная цель достигается тем, что диагностическое исследование производят только с кровью больного, при этом исследуют 2 пробы крови больного при различном времени экспозиции с объектами фагоцитоза или при одном времени экспозиции, но с добавлением в одну из проб крови растворимой специфической субстанции микробов и рассчитывают величину отношения фагоцитоза двух объектов (индекс) по формуле

Индекс Величина соотношения специфического и неспецифического объектов в пробе с добавлением растворимой микробной субстанции (с большей экспозицйей)/Величйна соотношения фагоцитоза специфического и неспецйфй- ческого объектов в пробе без добавления раствормой микробной субстанции (с меньшей экспозицией) и при величине отношения меньше 0,75 диагностируют инфекцию.

Основанием к применению этого способа служат два момента Первый момент заключается в том. что у здоровых лиц или лиц, не имеющих специфической реакции, при различном времени экспозиции крови со смесью двух объектов происходит пропорциональное увеличение их фагоцитоза, а при наличии специфической реакции соотношение уровней фагоцитоза специфического и неспецифического объектов меняется в зависимости от времени экспозиции. Второй момент связан с возможностью наведения йн витро специфического повышения ФАЛ при воздействии специфической растворимой микробной субстанций на кровь контрольных лиц и лиц, не имеющих специфического процесса, тогда как у больных со специфической инфекцией при- является подавляющее действие этой субстанции на фагоцитоз специфического объекта, что также можно выявить по изменению соотношения уровней фагоцитоза специфического и неспецифического объектШ.

Отличие заявляемого способа От известного заключается в том, что в заявляемом способе определение фагоцитоза производят только с кровью больного без дополнительного исследования фагоцитоза контрольных лиц, а наличие специфических изменений ФАЛ определяют по изменению соотношения уровней фагоцитоза специфического и неспецифического объектов -при различном времени экспозиции смеси крови больного с объектами фагоцитоза, или до и после дополнительного контакта крови больного с растворимой специфической

0 микробной субстанцией (способной навести специфическую реакцию крови контрольных лиц), тогда как в известном способе необходимо дополнительное исследование ФАЛ у контрольных лиц.

5 Способ осуществляют следующим образом. Исследование ФАЛ производят с равной смесью 1 %-ных взвесей специфических и неспецифических эритроцитов. В качестве специфического объекта используют

0 предварительно окрашенную голубым анилиновым красителем 1 %-ную взвесь антигенного эритроцитарного диагностикума для РПГА или фиксированный на эритроците сложный комплекс антиген-антитело-спе5 цифический микробный поли- или липополисахарид. С целью микроскопического различения от эритроцитов, содержащих специфический антиген, неспецифические эритроциты также заранее

0 окрашивают анилиновым красителем бордо или черным и готовят 1 %-ную взвесь эрит- роцитов. В качестве растворимой специфической микробной субстанции используют элюировавшую в физраствор с эритроци5 тарного диагностикума специфическую растворимую микробную субстанцию (суперлиц) или вакцину в разведении 10 (также способную наводить специфическую реакцию клеток крови контрольных лиц).

0 Проколом пальца больного набирают 0,1 мл крови и смешивают с 0,1 мл раствора Тлюгйцира (или другого антикоагулянта) во избежание свертывания крови. Концентрируют лейкоциты, производя центрифуги5 рование в течение 10 мин приЈ00 об/мин и Основную массу плазмы с консервантом удаляют, затем кровь тщательно перемешивают.

Применяют 2 варианта постановки ре0 акции,, ; ; В первом варианте при определении специфической реакции в зависимости от времени экспозиции кровь больного в объеме 10 мкл вносят в пробирку и добавляют 10

5 мкл равной смеси однократно отмытых физ- раствором 1 %-ных взвесей специфического (голубого цвета) и неспецифического (черного цвета) объектов фагоцитоза. После тщательного перемешивания пробирку

помещают в термостат при температуре

37°С при периодическом встряхивании. Гоовят мазки в виде узких ровных мазков на одном предметном стекле в поперечном направлении с помощью Устройства для изготовления мазков, либо обычным способом - один мазок на одном предметном стекле через 5-10 мин (меньшая экспозиция) и 20 30 мин (большая экспозиция).

Во втором варианте, осуществляемом путем дополнительного воздействия на кровь растворимой специфической субстанции, кровь больного в объеме по 10 мкл вносят в две пробирки. В первую (контрольную) вносят 5 мкл физраствора, а во вторую - 5 мкл растворимой специфической микробной субстанции и после тщательного перемешивания обе пробы помещают в термостат при 37°С на 20 мин. Затем в обе пробы добавляют по 10 мкл равной смеси специфического и неспецифического диат- ностикумов, тщательно перемешивают и вновь помещают в термостат на 10 мин при периодическом встряхивании. После этого готовят мазки из обеих проб одномоментно на предметном стекле. Мазки высушивают, фиксируют и окрашивают по Романовско- му-Гимзе. При этой окр аске неспецифические эритроциты приобретают черный цвет и хорошо отличаются от специфических, которые окрашиваются в синий цвет. Под иммерсионным объективом определяют фагоцитарную способность 100 нейтрофи- лов. Фагоцитоз учитывают только в изолированно лежащих лейкоцитах, избегая подсчета в конгломератах клеток. В каждой клетке учитывают количество фагоцитиро- ванных специфических (синего цвета) и неспецифических (черного цвета) объектов. Затем вычисляют среднее число фагоцити- рованных специфических и неспецифичеких эритроцитов на лейкоцит (фагоцитарное число). Изменения фагоцитоза специфического и неспецифического объектов при меньшей экспозиции принимают за 100% и выражают в процентах к ним показатели пробы при большей экспозиции. Поазатели пробы без воздействия специфической микробной субстанции также принимают за 100% и выражают в процентах к ним показатели пробы после воздействия специфической растворимой микробной субстанции. Полученную от деления величину обозначают как индекс специфического сдвига фагоцитоза (И СФ). иагностически значимым признают пониение величины индекса ниже 0,75. Повышение индекса выше этой величины казывает на отсутствие указанной инфекии.

Пример осуществления способа при диагностике кори,

В качестве специфического объекта фагоцитоза использовали 1 %-ную взвесь эрит- роцитарного антигенного сухого коревого диагностикума для РПГА производства Ленинградского НИИЭМ им. Пастера. В качестве неспецифических использовали 1 %-ную взвесь гриппозных антигенных эритроцитов типа А для РН ГА производства Одесского предприятия по производству бактерийных препаратов,

Для диагностики использовали применение варианта определения специфиче- ской реакции путем воздействия на кровь больного растворимой специфической микробной субстанции - супернатанта.

Поданным исследования в контрольной пробе (с физраствором) фагоцитарное число в отношении специфического объекта составило 0,28, а в отношении неспецифического - 0,36. В пробе после воздействия растворимой специфической субстанции (супернатанта коревого диагностикума) показатели составили 0,09 (32%) и 0,25 (69%) соответст49 °L венно. ,46.

Заключение: У больного имеется коревая инфекция.

Всего было обследовано 68 больных корью в различные сроки заболевания (от периода инкубации до 6-8 дня высыпания). Из них при применении известного способа положительная реакция на корь была выявлена у 57 человек (83,8%) и у 11 (16,2%) реакция не выявилась. Однако при обследовании этих 11 детей по заявляемому способу еще у 5 больных была выявлена положительная реакция на корь, что в сумме

составило уже 62 из 68. Таким образом, диагностически значимый результатбыл выявлен у 91,2% больных.

С целью дифференциальной диагностики исследование было проведено у 20 больных с краснухой и с аллергическими реакциями кожи. У всех этих больных реакция на корь была отрицательной. Следует отметить, что 11 из этих детей поступили с подозрением на корь, однако диагноз был

впоследствии снят.

Пример осуществления заявляемого способа при диагностике гриппа.

В качестве специфического объекта фа- гоцитоза использовали 1 %-ную взвесь гриппозных антигенных эритроцитов типа А для РИГА производства Одесского предприятия по производству бактерийных препаратов, в качестве контрольных - 1 %-ную взвесь эритроцитов сухого коревого антигенного диагностикума для РПГА производства Ленинградского НИИЭМ им. Пастера.

Для диагностики использовали применение варианта определения специфической реакции путем воздействия на кровь больного растворимой специфической микробной субстанции-супернатана специфического диагностикума.

По данным исследования в контрольной пробе (с физраствором) фагоцитарное число в отношений специфического объекта составило 0,15, а в отношении неспецифичё- ского - 0,10. В пробе после воздействия растворимой специфической субстанции (супернатана) показатели фагоцитоза специфического объекта составили 0,07 (47%) и неспецифического - 0,10 (100%). ИСФ е 47%- 6 ; . .

. Заключение: у больного имеется гриппозная инфекция.

Всего было обследовано 170 больных с подозрением на грипп. По известному способу специфическая реакция была выявлена у 134 (78,8%). При обследовании по заявляемому способу у 20 из оставшихся 36 человек были выявлены специфические для гриппа изменения ФАЛ и таким образом диагностически значимый результат был выявлен у 154 из 170 больных (90,6%).

С целью дифференциальной диагностики исследование было произведено у 36 детей, поступивших с подозрением на энтеровирусную инфекцию. Ни у одного из них специфических для гриппа изменений ФАЛ выявить не удалось.

Пример осуществления заявляемого способа при диагностике дизентерии Зонне.

В качестве специфического объекта фагоцитоза использовали 1%-ную взвесь антигенного эритроцитарнбго сухого диагностикума для РИГА из шигелл Зонне производства Ленинградского НИИ вакцин и сывороток, а в качестве неспецифических - 1 %-ную взвесь антигенного эритроцитарно- го сухого дизентерийного диагностикума из шигелл Флекснер того же НИИ вакцин и сывороток.

Наличие специфической реакции определяли при различных сроках экспозиций. Пробы крови больного смешивали с равным объемом 1%-Ных взвесей двух объектов фагоцитоза и готОШли мазки после 5 и 20-минутной экспозиции.

Поданным исследования при меньшей экспозиции фагоцитарное число в отношении специфического объекта составило 0,42, а в отношении неспецифического - 0,25. В пробе при большей экспозиции показатели фагоцитоза специфического объекта составили 0,51 (121%) и 0,55 (220%) неспецифического соответственно. Индекс

191 °L , 1° п яя

220% и-ьь- .

Заключение: у больного имеется дизентерия Зонне. Бактериальное подтверждение было получено значительно позднее. Учитывая, что основным методом диаг0 ностики таких вирусных заболеваний, как корь и грипп, является серологическое обследование, результаты которого имеют лишь ретроспективное (исследование титров антител в парных сыворотках на 10-12

5 день от начала заболевания), а заявляемый способ иммунодиагностики позволяет уточнить диагноз заболевания в день исследования, прост, нетрудоемок и не требует специального оборудования, он может быть

0 использован как для диагностики указанных заболеваний, так и для их дифференциальной диагностики от сходных с ним по клиническим признакам заболеваний. Заявляемый способ более точен, так как

5 при исследовании ФАЛ одного и того же лица в динамике наблюдаются гораздо менее выраженные колебания соотношения фагоцитоза специфического и неспецифического объектов и соответственно меньше ва0 риации величины ИСФ, чём при одновременном исследовании ФАЛ у различных лиц, что подтверждается данными, приведенными в табл.1.- ;

Очевидно, что колебания соотношений

5 фагоцитоза у различных лиц при одной экспозиции более выражены, чем вариации у одного и того же лица при разном времени экспозиции.

Заявляемый способ менее трудоемок

0 (на одну треть как минимум), поскольку для уточнения диагноза требуется исследование двух мазков, в отличие от известного способа, где необходимо исследование как минимум трех мазков (один мазок больного

5 и два у контрольных лиц для вычисления средних величин уровней фагоцитоза.

Вариации величины соотношения фагоцитоза двух объектов в серии проб крови одного обследованного донора (А) пред0 ставлены в табл. 2.

Вариации величины соотношения фагоцитоза двух объектов в серии параллельных проб крови группы обследованных (Б) представлены в табл. 3.

5 Большая точность определения ИСФ при исследовании проб крови одного человека в сравнении с определением ИСФ в пробах различных здоровых людей доказывают данные вариации величины ИСФ в этих исследованиях. В серии исследований

7 проб человека (А) вариаций величины ИСФ были в пределах 0,84-1,18 и коэффициент вариаций величины ИСФ составил 12,0%. При определении ИСФ в серии проб крови

8 здоровых людей (Б) вариации ИСФ были в пределах0,74-1,31 и коэффициент вариации величины ИСФ составил .17,8%. Соответственно этому диапазон колебаний величины ИСФ в заявляемом способе меньше и диагностическим значением в заявляемом, способе является изменение величины ИСФ при соотношении показателей фагоцитоза двух объектов меньше 0,75.

Использование: изобретение относится к медицине и может быть использовано для иммунодиагностики инфекций. Цель: повышение точности и уменьшение трудоемкости способа. Сущность изобретения: указанная цель достигается тем, что диагностическое исследование производят только с кровью больного, при этом исследуют 2 .- ,. 2 . . ... ...,.,,..,.,...,., пробы крови больного: при различном времени экспозиции с объектами фагоцитоза или при одном времени экспозиции, но с добавлением в одну из проб крови растворимой специфической субстанции микробов и рассчитывают величину отношения фагоцитоза двух объектов (индекс) по формуле Йндекс Величина соотношения специфического и неспецифического объектов в пробе с добавлением растворимой микробной субстанции (с большей экспозицией)/Величина соотношения фагоцитоза специфического и неспецифического объектов в пробе без добавления растворимой микробной субстанции (с меньшей экспозицией) и при величине отношения меньше 0,75 диагностируют инфекцию. 3 табл. -5 fe

Формула изобретения Способ иммунодиагностики инфекций путем определения фагоцитарной активности лейкоцитов крови больного при инкубации её со специфическим ине- специфичееким объектами фагоцитоза с оценкой результатов реакции по величине индекса специфического изменения фагоцитоза, определяемого по соотношению уровней фагоцитоза двух объектов у больного в сопоставлении с их соотношением у донора, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с

Вариации соотношения уровней фагоцитоза специфического (в числителе)

и неспецифического (в знаменателе) объектов при различной

экспозиции и при сопоставлений проб двух доноров

целью повышения точности способа, исследование фагоцитарной активности со специфическим и неспецифическим объектами

ведут в пробах крови больного при другом значении времени инкубации или при таком же значении времени с добавлением растворимой субстанции микробов, далее рассчитывают индекс специфического изменения фагоцитоза по величинам соотношения фагоцитоза двух объектов во второй пробе к первой и при значении индекса меньше 0,75 диагностируют инфекцию.

.- .. а б л и ц а 1

Таблица 2

Та бл и ц а 3