Штамм бактерий BacILLUS тнURINGIеNSIS VaR КURSтакI для получения инсектицидного препарата Советский патент 1993 года по МПК A01N63/00 C12N1/20 

Изобретение касается получения нового инсектицидного препарата на основе нового штамма Bacillus thuringlensis Varo mdrrisonl NRRL В - 18196.

Инсектицидный препарат используется для борьбы с видами насекомых отряда Чешуек эылых, в частности,TRICHOPLUSIANI, совка капустная и ARTOGEIA RAPAE ик портированные мермитиды.

Спорообрээующий микроорганизм B.:huringiensls был изолирован свыше 80 лег тому назад, и с тех пор стал коммерчески известным в отношении биологической борьбы с вредителями. Спорообразующие клетки B.thutinglensis каждая продуцирует спору (эндоспору) и ромбовидный белковый кристалл (параспору или тельца включения). Эмтомоцидные свойства приписываются

исключительно б-эндотоксину, который является основным компонентом параспо- рального кристалла. Когда кристалл переходит в растворимое состояние в кишке насекомого, он вызывает образование про- токсина, который активизируется в результате протеолитического расщепления.

Являясь довольно специфическим видом в отношении Чешуекрылых насекомых и некоторых мух и мостиков, B.thuringiensls является безвредной по отношению к невосприимчивым отрядам насекомых, животным и человеку. В настоящее время в США. В. thuringiensls разновидности kurstahl включает инсектицидные продукты В. thurlngiensis, наиболее широко используемые для борьбы с этими вредителями. Одна00 W

VI

х|

VI Сл)

СО

ко эти продукты недостаточно эффективны при промышленном применении.

С другой стороны, синтетические пирет- роиды являются химическими инсектицидными агентами, наиболее широко используемыми для борьбы с Чешуекрылыми вредителями, Пиретроиды являются высокоэффективными и обеспечивают более сильную борьбу с вредителями по сравнению с используемыми в настоящее время инсектицидными продуктами B.thuringiensls, Однако недостаток, связанный с использованием пи- ретроидов, состоит в том, что они являются токсичными в отношении непреследуемых беспозвоночных, тем самым представляя опасность для окружающей водной среды. Поэтому существует потребность в эффективных активных против чешуекрылых инсектицидах, которые безопасны для окружающей среды, эффективны по стоимости и которые дублируют эффективность синтетических пиретроидов.

Цель изобретения состоит в получении инсектицидного препарата на основе нового штамма B.thurirtglensis Var, morrisoni NRRL B-18196 для уничтожения видов насекомых отряда Чешуекрылых, в частности Trichqpiuslanl, совки капустной, и Artogela гарае; /импортирооанными мер- ммтмдами

Новый штамм B.thuringiensls был депонирован в коллекции культур в Северном Региональном Исследовательском центре департамента сельского хозяйства США, Пеория, Иллинойс 61604, под регистрационным номером NRRL B-18196. Потомство этого штамма будет относиться к NRRL.

Новый штамм является спррогенным, кристаллообразующим мутантным штаммом выделенных из окружающей среды В, thuring iensis и имеет способность продуцировать бипираммдальные кристаллы, состоящие из токсичного белка, и является уникальным в том отношении, что является ауксотрофным по лейцину и валину для роста, спорулядии и продуцирования кристаллов. В противоположность этому ранее наблюдаемые штаммы В. thuringiensis проявляли ауксотрофность, которая удовлетворялась без аминокислоты, K.W.NIckercon et al, Appl, Microblot, 28, 124-128 (1974),

Термин ауксотрофия здесь определяется в значении потребности в питательных веществах, необходимых для роста, спору- ляц ии и продуцирования кристаллов микроорганизма.

Фраза амино-кислотный комплекс питательной среды определяется здесь для обозначения питательной среды, содержащей комбинацию двух или более аминокислот.

Новый штамм NRRLB-18196 размножен из почвенного слоя, используя неклассический способ отбора посредством ацетата натрия и теп пэ. В соответствии с этим спо- собом водная питательная среда буферизуется примерно до 0,25 М ацетатом натрия, чтобы допустить зарождение только нежелательных спорообразующих организмов,

.присутствующих в образце окружающего

почвенного слоя. Затем выращенные

спорообразующие организмы и неспорообразующие организмы в образце умерщвлялись путем тепловой обработки. Выжившие споры после этого высеивались на чашки и выращивались на соответствующей агаровой питательной среде для получения новых штаммов согласно изобретению. Не прибегая к какой-либо конкретной теории, предполагается, что новые штаммы согласно изобретению образуются во время процесса отбора в результате мутагенеза, естественно происходящего в штаммах

B.thuringiensfs с последующей обработкой ацетатом натрия и теплом.

Примером способа селекции Является следующий: 0;5 г почвы было добавлено в 10 млс L-бульона (100 млс воды, 1 г триптона,

0,5 г экстракта дрожжей, 0,5 хлористого натрия) в 125 мл дефлекторной колбе. L-бульон был буферизован до 0,25 М ацетатом натрия. Смесь встряхивалась в течение 4 часов при 250 об/мин и 30°С. После использовамия проточного теплового устройства пастеризации смесь нагревалась при 80°С в течение 3 минут. Термообработаниая смесь высеивалась на чашки с L-агаром (L - бульон, (утвержденный с помощью 1,5 % агара)

и инкубировалась в течение ночи (1-6 часов) при 30°С.

Штамм NRRL B-18196 имеет следующие характеристики: колонии являются круглыми, цельными, выпуклыми и кремового цвета с диаметром колонии 2-7 мм на питательном агаре после 24-часов. Вегетативные клетки являются аэробными, грам- положительными, подвижными палочками

размером 1-1,2 мкм на 3-5 мкм. Концевые (верхушечные) споры вегетативных клеток не раздувают спорангий и составляют от 33 до 50 % вегетати-вных палочек. Клетки являются положительными по каталазе, ферменту глюкозы, гидролизу казеина, но вопреки таксономическому описанию прежде наблюдаемых штаммов В. thuringiensis штаммы согласно изобретению не используют цитраты. Новый штамм также не ферментирует маннит, эрабинозу и ксилозу.

Дополнительно штамм NRRL В-18196 глдролизовал крахмал, ферментировал сахарозу и продуцировал лецитиназу; клетки е е использовали эскулин, не продуцирова- /и уреазу, не ферментировали салицин и V. 1; 1тамм является стойким по отношению к Ј нтибиотикам пенициллинового типа, та- ким как нафициллин, ампициллин и мети- чиллин, и является стойким по отношению (низким уровням, т.е. около Юг/мл, неоми- 1,ина, канамицина и бромида этида.

Как сказано выше, продуцирование с пор и белковых кристаллов штаммом В. thuringiensls имеющим характеристики NRRL В-18196, требует водной питательной реды, которая содержит лейцин-валино- пый аминокислотный комплекс. Для оптимального образования кристалла бактерией согласно изобретению предпочтительный состав, специальной питательной среды яв- яется следующим: 0,3 % триптона, 0,2 % риптозы, 0,45 % дрожжевого экстракта, юлученного 0,01 М в буфере фосфата на- рия при рН 6,8 с добавлением 10 MgS04 MnS04 после обработки в автоклаве. Штамм выращивают при температуре 0°С при 250 об/мин в 2-х литровых кониче- :ких колбах Эрленмейера с тройными пере- ородками с объемом 25 % и хранят при емпературе 25°С на среде ТЗ, отвержден- ной 1,5 % агаром.

Другая соответствующая питательная :реда, имеющая-требуемый аминокислотный комплекс, может использоваться для зыращивания бактерий согласно изобретению. Однако используемая иная питательная среда, нежели предпочитаемая питательная среда, может привести к уменьшенному образованию кристаллов.

Продуцирование клеток производится в аэробных условиях при любой температуре, довлетворительной для роста микроорганизмов согласно изобретению, т.е. примерно от 10°С до 40°С; предпочитаемый диапазон температуры между 27°С и 32°С. Величина рН питательной среды, соответствующей для выращивания культуры В. thuringlensls близка к нейтральности, т.е. рН от 6,7 до 7,2. Время инкубации является временем, необходимым для полного освобождения споры и кристаллами предпочтительно составляет от 18 до 24 часов. Клетки могут выращиваться в любой дефлекторной встряхиваемой колбе в ряде небольших опытов. Для операций в более крупных масштабах удобно выращивать культуру в резервуаре, применяя помешивание и аэрацию в отношении инокулированной жидкой питательной среды. После инкубации клетки собираются традиционным способом седиментации, как, например, центрифугированием или фильтрованием. Клетки могут использоваться как таковые или в .замороженном виде для последующего ис- 5 пользования.

Для получения инсектицидной композиции, содержащей штамм B.thurlngiensis var. morrisoni NRRL В-18196 в качестве активного ингредиента, штамм, который составляет

0 до 30 % общего объема, смешивают с инертными ингредиентами, которые составляют остаточный объем, т.е. по крайней мере 70 % общего объема. Инертный ингредиент может быть просто разбавителем, напри5 мер, вода.

Другие инертные ингредиенты могут включать консерванты,агенты,контролирующие текучесть, клеющие вещества, эмуль- гаторы, распиливающие вещества,

0 поверхностно-активные вещества, наполнители и буфер. Используемый интервал доз составляет от 1.1 х 1010 до 5.1012 спор на 0,405 га. Инсектицид, содержащий мутант В. thuringlensls var morrisoni NRRL В-18196 в

5 качестве активного ингредиента в указанных дозах,является высокоэффективным в уничтожении насекомых отряда чешуекрылых, в особенности, совки капустной и импортированных мермитид (см. табл. ниже).

0 Пример способа получения инсектицидного препарата включает смешивание вместе с использованием воздушной мельницы, чтобы обеспечить размер частиц и гомогенность штамм NRRL В-18196, составляющий

5 до 30 % общего объема с инертными ингредиентами, которые составляют остальной объем. Эти инертные ингредиенты включают консервант, два поверхностно-активных вещества, агент регуляции текучести,разба0 витель и буфер. Смесь затем гранулируется с использованием техники сжатия (уплотнения) и упаковывается в воздухонепроницаемые, не содержащие влаги контейнеры. Инсектицидные препараты могут, разбрыз5 гивэться с использованием традиционных методик и разбрызгивающих устройств. Новый инсектицид может также инкапсулироваться или заключаться в соответствующий инкапсулирующий материал, как органиче0 ский полимер, и применяться в порошковой форме. Также предусматривается, чтобы генетический материал для б-эндотоксина нового штамма В. thurlngiensis мог быть . перенесен с использованием техники ре5 комбинатных ДНК в другие бактерии и растения для обеспечения усиленной борьбы против вредителей.

Нижеследующий пример предназначен иллюстрировать изобретение и не ограничивает объем притязаний, как он определен формулой изобретения.

В полевых испытаниях эффективность инсектицида, содержащего штамм NRRL В- 18196 в качестве активного ингредиента, против совки капусной и импортированных мермитид сравнивалась с эффективностью синтетического инсектицидного продукта, содержащего пиретроид, ПИДРИН и инсектицидного продукта В. thuringiensis.разновидности Курстаки МДИПЕЛЬ, ПИДРИН является товарным знаком продукта, продаваемого фирмой Шелл корпорейшн, и содержит 30 % циано (3-феноксифенил) метил-4-схлорэльфа (1- метил)тил) бензолацетата и 70 % инертных ингредиентов. ДИПЕЛЬ является товарным знаком продукта, продаваемого фирмой Абботт лабораториз, и содержит 3,2 % В. thuringiensis разновидности Курстаки и 98,8 % инертных ингредиентов.

Также испытывались два других новых инсектицидных препарата, содержащих в качестве активных ингредиентов штаммы B.thuringiensis varo Russtarl NRRL B-18197 и В-18195. Инсектициды на основе новых штаммов NRRL В-18197, В-18195 и В-18196 содержали 5,5хЮ9 спор на 0,5 л воды, 0,01 % общего объема составлял жидкий детергент (добавленный в качестве распыливаю- щего вещества) и остальной объем составляла вода.

На Восточном берегу Мериленда капуста листовая была прямо высажена семенами в 4-х рядных делянках по 609,60 см дайны 07 июля 1986 г. Растения отстояли друг от друга на 5.08 см в ряду и 91.44 см между рядамм. Обработка была организована по схеме рандомизированных блоков с 4 повторами. Каждый ряд был буферизован защитным рядом. Почва была супесчаной почвой Норфолк А. Все обработки опрыскиванием были 5,5 х 109 спор на 0,5 литра воды, в которую добавлялось 0,01 % жидкого детергента в качестве распиливающего вещества. Опрыскивания производились с помощью садового опрыскивателя тромбонового типа, калиброванного для подачи 113,55 л состава 0,405 га.

Ряды обрабатывались опрыскиванием 11,18 и 25 августа и 2 сентября и 8 сентября. 15 сентября производились оценки поврежденной листвы и количества насекомых. Давление насекомых из-за естественно происходящего нашествия совки капустной и импортированных мермитидов Оыло умеренным. Оценки повреждения листвы индексировались следующим образом:

1) 0-3 % повреждения - случайные отверстия на листьях;

2)4-10 % повреждения - несколько ли- стьев с отверстиями;

3)11-25 % повреждения -среднее/умеренное число листьев с отверстиями;

4)26-50 % повреждения - большинство листьев с отверстиями; и

5)51-100 % повреждения - повреждение корневой шейки и/или все листья с отверстиями.

Дзнные анализировались методом дисперсионного анализа, и средние значения

определялись с помощью испытания множественного ряда Дункана (DHRT) при Р 0,05 уровня (Дункан 1951). Результаты сведены в таблице.

Таблица ясно показывает 10-кратное

увеличение инсекционной активности инсектицида, содержащего в качестве активного ингредиента NRRL В-18196 по сравнению с коммерческим продуктом Дипел.

Такое увеличение было хорошо продемонстрировано, когда после обработки Дипелом уровень повреждений составлял

менее чем 10 %, что соответствовало обработке NRRL В-18196 при разбавлении 1:10.

Понятно, что модификации и изменения могут быть внесены в вышеприведенное описание без отклонения от идеи и объема изобретения

Формула изобретения Штамм бактерий Bacillus thuringiensis var. Kurstaki NRRL В-18196 для получения инсектицидного препарата.

1,Любые два числа в одной и той же колонке с последующей той же буквой значительно з отличаются (Р 0,05) DMRT

2.Распыление производилось 11,18,25 августа и 2,8 сентября.

| 3. Вред, причиненный, главным образом, совкой капустной и импортированными мерми- тидами,

I 4 ДИПЕЛ 7,26 миллиардов международных единиц на 373,2 ч. | 5 Калибровано по выходу 7,26 миллиардов международных единиц н 373,2 ч,