Фрагмент ДНК Советский патент 1992 года по МПК C12N15/31 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и представляет собой фрагмент ДНК, обусловливающий синтез З -аминогликозидаце- тилтрансферазы.

3 -аминогликозидацетилтрансфераза - фермент, продуцируемый клиническими штаммами микроорганизмов и обусловливающий инактивацию таких клинически важных антибиотиков, как гентамицин, тоб- рамицин, сизомицин и нетилмицин, в результате чего продуцирующий этот фермент штамм микроорганизма приобретает рези- стентность к перечисленным антибиотикам.

Известны детерминанты резистентное™, кодирующие гены аасС2 и продуцирующие фермент ААС(3)-11. Гены аасС2 выделены из штаммов, распространенных в Чили и Нидерландах.

На основании известной нуклеотидной последовательности сконструирован ДНК- зонд, представляющий собой Sphl-Sall фрагмент ДНК размером 0,8 т.п.н.

Целью изобретения является создание ДНК-зонда для выявления неизвестного ранее гена аасС2а.

Типы аминогликозидинактивирующих ферментов можно определить по профилю резистентности штаммов к аминогликозид- ным антибиотикам. По профилю резистентности, детерминанта устойчивости, клонированная нами, кодирует фермент типа ААС(3)-11а, не описанный ранее и отличающийся по профилю резистентности от фермента типа ААС(3)-11 более высоким уровнем резистентности к изепамицину - аминогликозиду, используемому для определения типов ферментов, инактивирующих гентамицин.

Для выявления штаммов микроорганизмов, содержащих ген, кодирующий фермент ААС(3)- 11 а, необходимо выделить детерминанту резистентности содержащую распространенный в СССР ген З -аминогликозидацетилтрансферазы типа 11а и на основании его нуклеотидной последовательности сконструировать ДНК-зонд. Этот зонд, используемый для выявления гена аасС2 в клинических штаммах микроорга(Л

ч о

00

о

о

низмов, может применяться в химиотерапии гнойно-септических и особо опасных инфекций.

Для достижения поставленной цели из R-плазмиды трансконъюганта штамма E.coli, продуцирующего фермент ААС(З)- 11 а, клонирована детерминанта резистент- ности к гентамицину, представляющая собой Hind III фрагмент размером около 2,3 т.п.н., и при помощи метода Сангера определена нуклеотидная последовательность этой детерминанты резистентности. Нуклеотидная последовательность Hind III фрагмента содержащего ген аасС2а, приведена в табл.1.

Ген, входящий в состав секвенированной детерминанты резистентности, содержит открытую рамку считывания размером 856 п.н., кодирующую фермент ААС(З)-11 и локализованную между 819 и 1676 нуклеотидами, начиная от 5 конца. Показано, что ген кодирует белок с мол.м. 30,6 килодальтон. Выявлено, что секвенированный ген содержит отличный от известных ранее промотор и ряд нуклео- тидных замен в структурной части. Эти изменения позволяют отнести секвенированный нами ген к типу аасС2а.

В табл. 2 представлены регуляторные области гена аасС2 из плазмид pWP14a, pWP116а и pJ V03, а также секвенированно- го гена аасС2а. Регуляторные области гена аасС2 из плазмид pWP14a и pWP115a идентичны регуляторной области плазмиды pJV03 за исключением участка протяженностью 20 п.н., присутствующего в промо- торной области плазмиды pJV03. Последовательность длиной 20 п.н. плазмиды pJVOo содержит альтернативный - 10 бокс промотора. В регуляторной области секвени- рованного гена в направлении к 5 концу, начиная от старт-кодона, расположен участок длиной 18 п.н., совпадающий с таковыми ре- гуляторных областей генов аасС2 плазмид pWP14a, pWP116a и pJV03. В этом участке расположена последовательность Шайна- Дальгарно GG AG. За гомологичным участком расположена последовательность длиной 9 п.н., отсутствующая в генах, секвенирован- ных ранее. Далее вновь следует область длиной 8 п.н., присутствующая в плазмидах pWP14a,pWP116anpJV03. Вслед за участками гомологии в гене из плазмиды pSV11 (плазмида p(JC19, содержащая Hind III фрагмент с геном аасС2а) следует протяженная область, абсолютно отличающаяся от регуляторных областей генов аасС2 плазмид pWP14a, pWP116a и pJV03.

При сравнении структурной части сек- венированного гена с геном из плазмиды

pWP113а показано наличие 3,5% замен нук- леотидов и 5,6% аминокислотных замен в молекуле фермента. При сравнении структурной части секвенированного гена со

структурными частями генов аасС2 плазмид pWP14a, pWP116a и pJV03 выявлено 3,15% нуклеотидных замен и 4,2% аминокислотных замен в молекуле фермента. На основании этих данных можно сделать вывод, что

0 секвенированный нами ген эволюционно ближе к гену из плазмид pWP14a, pWP116a и pJV03.

При сравнении последовательности структурной части секвенированного гена с

5 последовательностями структурных частей генов аасС2 плазмид pWP14a, pWP116a, pJV03 и pWP113a обнаружено в общей сложности 43 нуклеотидные замены, определяющие 20 аминокислотных замен в мо0 лекуле фермента, т.е. наблюдается 5,0% различий в нуклеотидном составе и 7,3% - в аминокислотном. Нуклеотидные замены, обуслоЕливающие замены аминокислот в последовательности гена,локализованы до5 статочно случайным образом. На основании определения степени гомологии секвенированного гена и известных генов аасС2. секвенированный ген отнесен к типу аасС2а. Для достижения цели сконструирован

0 ДНК-зонд, основанный на неизвестной ранее заявленной нуклеотидной последовательности клонированного фрагмента ДНК, содержащего ген аасС2а. ДНК фрагмента размеров 2273 п.н. подвергнут гидролизу

5 эндонуклеазой рестрикции EcoR V, образовавшиеся фрагменты разделен методом электрофореза в агарозном геле, фрагмент размером 537 п.н. элюирован из агарозы, очищаем при помощи двукратной экстра0 кции фенолом и двукратного осаждения этанолом. Полученный таким образом фрагмент ДНК радиоактивно или нерадиоактивно метят и используют в экспериментах по ДНК-ДНК гибридизации.

5Пример. Клетки клинического штамма

E.coli 164, резистентного к гентамицину, тобрамицину, сизомицину, нетилмицину и продуцирующего фермент ААС(3)-11а, выращивают в L-бульоне в течение ночи при

0 37° С. Из бактериальной суспензии изолируют ДНК R-плазмиды, имеющую мол.м. 70 Мд и содержащую детерминанту резистентности к гентамицину, тобрамицину, сизомицину и нетилмицину. Выделенную ДНК

5 гидролизуют эндонуклеазой рестрикции Hind III и лигируют с ДНК векторной плазмиды pUC19, гидролизованной эндонуклеазой Hind 111. Смесью, содержащей лигированные молекулы, трансформируют реципиентный штамм E.coli JM 101. Трансформанты, содержащие рекомбинантные плазмиды, отбирают на агаризованных средах, содержащих гентамицин в концентрации 10 мкг/мл. Отобранные трансформанты рассевают до отдельных колоний на агаризован- ной среде LB, содержащей 10 мкг/мл гентамицина. Отдельную колонию выращивают в жидкой питательной среде LB в течение ночи и выделяют ДНК щелочным методом. Проводят в стандартных условиях гидролиз плазмидной ДНК эндонуклеазной рестрикции Hind III и в присутствии маркеров молекулярной массы устанавливают, что детерминанта резистентности к гентамицину, сизомицину, тобрамицину и нетилмицину находится в составе Hind III фрагмента размером 2,3 т.п.н.

При помощи метода Сэнгера определяют нуклеотидную последовательность клонированной детерминанты резистентности. В результате компьютерной обработки результатов ген отнесли к типу аасС2а.

Из лабораторного штамма E.coli, содержащего рекомбинантную плазмиду pSV11, щелочным методом выделяют плазмидную ДНК в препаративных количествах. Проводят рестрикцию плазмидной ДНК эндонук- леазой Eco RV. Фрагмент размеров 537 п.н. вырезают из геля, проводят электроэлюцию в диализный мешок, очищают двукратной экстракцией фенолом, двукратным осаждением этанолом. Радиоактивное мечение фрагмента проводят реакцией ник-трансля- ции. Радиоактивно меченый фрагмент используют в качестве зонда в экспериментах

по ДНК-ДНК гибридизации.

Таким образом, определена нуклеотид- ная последовательность гена аасС2а. Сконст- руированный на основании этой последовательности гибридизационный

зонд, представляющий собой Eco RV фрагмент размером 537 п.н., может быть использован для выявления этого гена. Полученный в результате осуществления поставленной цели зонд радиоактивно или нерадиоактивно

метят и используют в экспериментах по ДНК- ДНК гибридизации. Результаты, полученные при гибридизации со сконструированным из ДНК гена аасС2а зондом, могут применяться для рационального выбора антибиотика вхимиотерапии гнойно-септических и особо опасных инфекций.

Формула изобретения Фрагмент ДНК, содержащий ген резистентности к аминогликозидам аасС2а, кодирующий 3 -аминогликозидацетилтрансферазу типа 11а, полученный в результате элюции из геля продукта гидролиза рестриктазой Hind III рекомбинантной плазмиды pSV11, реплицируемой в лабораторном штамме Escherichia coli

KI2, размером 2273 п.н. со следующей нуклео- тидной последовательностью.

Таблица

IV 2U 3 4ft 50 7У 80 90 100 110 1 TTTGGTftCTC ТСЙБААТАСС CTTTTGAGTT CGTTTTTGTG CCAACAGAAC AGCCCGTAGG TAAftTCTCGG AGCATTTCAG GAflGTGTCTG TGTGAGTTGft ATCTGAftTGG

111СйбТТААТАТ TTTAGTGGTC PAGGTCFAG GCGftGTTGAA TGChSGGCWCCTCGTTTTT TSGCftGGCG6 TTTTACAACfi GGAGGEAGAA СТАПТТСТС ААСАССТТС6

221C6TGCTGGAA TCATGGTTGC ATCACGGACT AATAT6PCCG ATTAAC3TATСС6СЙАБЙТГ GGftCTTCACC ЙТСТБСТСАТ GAACGCGAGT G&TTAGTTTA CGCGCTGCAA

331АТТСЙ6СААА AACPCGGCTA ААТ6ТСССП CGCTGGGTAG ПТТТТнТЙСAGATTGAAGC CeCAAATTCG CCGCAATCTA CGATCAACTT CTAGGC6TTC AATCAA6CCC

441CGTGTGGTGA CGATAffiAAG TTCAGCTTTT CCAATAPAAG 3CACA13XAAAGCGCftGCG GTCA3CAGGA GGTCTTCCCA САБСАСАССС TTGATATTG6 TATACCAAGG

51 ATTCGATGTC ACTCCACTCG AGCACACGAA TAATGCGTTL EAGCTTT6A6 CTGATGCCGT CCTAAATCGG CTGCGACTAA AG6AATAAGT TCGTATTSTA AGKTTGAAA

-35 TTGACA -10 TATAAT 661 CCGTTGTTTG AGAAAAGGGC TTAATGTAGT ATFCATGCT6 TfiGATGTTAG GGTGTTGGTT ТАБААБСТСА TTTTAACATC TACAACTTTT TTCAAAAAAT GTTAATTCAG

Met 771 GCT6TTT6TE &AGTTTTGCA AGTGCCTCGA TTTP3ACGA6 PTATC5C6AT GCATftCGCSG AA6GCAATAA CGGAGGCGCT ГСАААААСТС GGAGTCCAAA CCGGTGftCCT

/

831 AITGATGGTG CATGCCfCAC TTAAftXEftT TGGTICSS C GAA3Gf,G3AC CGGHGACbGT CGTTGCCGCG TTACGCTCCG CG6TTGGGCC 6ACTGGCACT GTGA1EGGAT W uCeLATCGTG GEAClGATCT CCC ftCGftGb РЕАСТССГяй TS5CGCTC6G Ттс-ЗЙТБЙСЙ eflACCCGCCG TACCT6C-:CG CCGTTCGATC CC6CAACGGC CGGSACTTAC

lli.l 3GTGGGTTCG GCCT6CTGAA TCAGTTTCTG ETTCfl iGCCC CCG3CGCGCG GCUCftGCGCG LACCCCGftTG CATCGAT6GT CGCGGTTGGT CCACTEGCT6 AAAC3CTGAC 121 36AGCCTCAC AAGCTCS6TC ЙСБССТТ66Б 3G-i№CGTCG СССбТСЁнЕС GGTTCGTTCG CCTTGGCGEG AAG6CCCTGC T6TT66GTGC GCCGCTAAAC TCCGTTACCG i::i CATTGCACTA СБССЗЙБ6С5 GTTGCCWTA TCCCCPACAA iiCGGCGGGTG ACGTAT&RbA TGCCGATBCT TGGAAGCAAC GGCGAAGTD3 CCTGGAAAAC GGCATCGGAT H:I THCGATTCAA ACGGCATTCT CGATTGCTTT GCTATCGAAG GHAAGCCGGA TGCGGTCSAA ACTATAGCAA АТБСТТАСБТ ЕААБСТСББТ CGCCATCGAG AAGGTGTCGT 1541 65GCTTTGCT CAGFGCTACC TGTTC3AC5C GCHG5ACATC GTGACBTTCG 6CGTCACCTA TCTTGASAftG CATTTCGGAA CCACTCCGAT CGTGCCAGCA CACGAAGTCG 1651 CCGAGbCTC TTGC3ACCCT TCACGTTAGA GCLCGTCGrfC ААТЗйТйАТС TGCATCAACG EACCTTTCGG CGCGGGAAA6 ACGACGCTC5 CTGAGCG5TT GCGCGATCT-G 1761 C6TTCCAAAT С8СТЕЙТСТТ TGACCCCCAG CfiP TCSGGT TCGTISTGAA AGAAACGGTC CCCATGCCGG CGAECGbflGA CTrtTCAGGAT СТСГТАПч ЗСМТТААТС

157i СААЙИАЛ6С ССЙОРРР6ТТ AATAATCTftG AAT CTTTCC LTT6PuT(3TTCAAAGGAACT TCTAATAAAT ЙПйТТИнБ AAAATArifiCA АТСТйТТСРйАнМТТСмйБ

1481 ААйтАТТйСА ТАССйТАйИ CCiGTTCAGT TATCT6PAGA TTCTSAPAATGAATA ЧС GA&rGCTGTC AAAATCAATA AATGCAGCAT TTAAAAACT3CGC-ftGCCAAA

:u9 C A3bAGAAh TTATTnHSG ЗСЙАСАГА А АтАй:-ТТАБ ujf 3T:TK J№№M TTPtCTCCTT 6GATAAATCA TPPCATCAAG ААйТнБАСЛTTAA Tjf,A:

21i 1 CrriiTTCTTA AASTTCTAbT f TLA:ATCт ftSCTGCTHG ВДртисААТАТТЯ:ССАТА CCCTGCTTTT TAA

Таблица2

Использование: биотехнология, генетическая инженерия. Сущность изобретения: из R-плазмиды трансконьюгата клинического штамма E.coli выделена детерминанта рези- стентности к гентомицину размером 2273 п.н., содержащая неизвестный ранее ген аасС2а, определена нуклеотидная последовательность этой детерминанты. 2 табл.

(DWP116A) Met His ThrlArg Lvs Ala Us TnrGlu AlallleHArglLys Lsu 51 v Va

(oSVii) 1 Met His ThrlArg Lys Ala lie R--61u Ala I Leu1- iGlnllvs Leu 31s Val

(DWP113A) Met His T rlGlnl Lys Ala He ThrGlu Alalleul iGlnAys Leu Glv Val L JrUJL J

Gin ThrJGlylAsp Leu Leu Ket Val His Ala Se- Leu LysJAlallle Gly Fro Val Glu

17 Gin ThrlGlvlAso Leu Leu Met Val His Ala Ser Leu Lvs Alaille 61 v Vsl Glu

Gin ThrlSerlAsD Leu Leu Met Val His Ala Ser Leu LvslSerllle Glv fro Val Glu

Gly Gly Ala Glu Thr Val Val Ala Ala Lea Arg Ser Ala Val Gly Pro Glv Thr

36 Glv Gly Ala Glu Thr Val Val Ala Ala Leu Arg Ber Ala Val Glv Pro Thr Gly Thr

Gly Gly Ala Glu Thr Val Val Ala Ala Leu Arc Ser Ala Val Gly Pro Thr Gly Th|1

Val Met Gly Tvr Ala Ser Tro Aso Arg Ser с го Туг Glu Glu Thr I Leu1 ASP Gly Ala

55 Val Met Glv Туг Ala Ser Tro ASD Arg Ser cro Tyr Glu Glu ThrlArglAsr, Glv Ala Val Met Gly Tyr Ala Ser Tro ASD Arg Se Tvr Glu Glu TnrlueulAsn Gly Ala

Arg Leu ASD AsulLysl JAlalArg Arg Thr Trp Pro Pro Phe ASD Pro Ala Tnr Ala Glv

74 Arg Leu ASD Aso1LvsSiThriArg Arg Thr Fro Pro Phe ASD Fro Ala Ttr Ala Sly

Ara Leu ASD AspJAsnllAlalAra Ara Thr Tro Pro pro Phe ASD Pro Ala Thr Ala Giv

r i,i. Tyr Arg Gly Phe Gly Leu Leu Asn Gin phe Leu Val Gin AU Fro Gly Ala Arg

93 Thr Tvr Arg Gly Phe Glv Leu Leu Asn Gin гЬе Leu Val Gin Ala Pro Glv Ala Arg

Thr Tyr Arg Gly Phe Gly Leu Leu Asn Gin Dhe Leu Val Gin Ala Pro Glv Ala Arc

Arg Ser Ala His Pro Aso Ala Ser Met Val Ala Val Glv Pro Leu Ala Glu Thr Leu

112 Arg Ser Ala His Pro ASD Ala Ser Met Val Ala Val Glv Pro Leu Ala Glj Thr Leu

Arg Ser Ala His Pro ASD Ala Ser Met Val Ala Val Glv o Leu Ala Glu Thr Leu

Thr Glu Pro HislGlulLeu Glv His Ala Leu Glv Glu Gly Ser WiVailGlu Arg Pns

131 Thr Glu Pro HislLyslLeu Gly His Ala Leu Gly Glu Gly Ser -rolVal Glu Arg

Thr Glu Pro HislGlulLeu Gly His Ala Leu Glv Glu Glv Ser Fro Asn .Glu A-g Fhe

Val Arg Leu Glv Glv Lys Ala Leu Leu Leu Glv Ala Fro Leu Asn SerVal Thr Ala

150 Val Arg Leu Gly Gly Lys Ala Leu Leu Leu Gly Ala F ro Leu ASP 5s Val Thr Ala

Val Arg Leu Glv Gly Lys Ala Leu Leu Leu Gly Ala F rc Leu Asn SerVal Thr Ala

Leu His Tyr Ala Glu Ala Val Ala ASD lie Pro Asn Lys ArgiT-oiValTbr Tyr Glu

169 Leu His Tyr Ala Glu Ala Val Ala ASD He Pro Asn Lys A-g qrgb lThr Tvr Gij

Leu His Tyr Ala Glu Ala Val Ala ASD lie D-o Asn Lys ArghrolValTir Ту- Glu

Met Pro 161у IArg i Met Pro Met I Leui61 у ISer

Met Pro Met

GlyIArg

fisnlGly Glu Val Ala Tro Lvs Tbr Ala Eer Glu Tyr A;D lAsrHGly Glu Val Ala Tro Lvs т Ala beriAsoHyr ASP

IftsolGlv Glu Val Ala T-о Lvs Thr Hi a ASD Ii ,,l

Tbr

Ser Asn Gly lie Leu Aso Cvs Phe Ala He Glu Glv Lvs pro Asorila al 51 j Tbr

7 Ser Asn Gly He Leu ASD Cvs Phe Ala He Glu Glv LvslPro Asjч a al 3u TrSer Asn Gly He Leu ASD Cys Phe Ala He Glu Glv Lys GlnlHsoАи з G .u Trr

11