1
(21)4453532/30-13
(22)04.07.88
(46) 23.12.90. Бюл. № 47
(71)Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промыишенных микроорганизмов
(72)Ю.И.Козлов, Ю.В.Йомантас, Т.И.Уланова, Н.В.Стойнова
и В.А.Народицкая
(53)575.224.2.577.2/048(088.8)
(56)FEMS Micrubiul. Lett. 1988, V.99, p. 101.
(54)ВЕКТОР рВА48, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ КЛОНИРОВАНИЯ ФРАШЕНТОВ ДНК В БАЦИЛЛАХ
(57)Изобретение относится к биотехнологии и микробиологической промьшленности и может быть и спользовано для создания промышленных продуцентов. Цель изобретения состоит в повышении стабильности наследования фрагментов ДНК в условиях отсутствия селективного давления. Получен вектор, способный реплицироваться в бациллах, в частности в В. subtilis и в промышленных штаммах B.amyloli- quefaciens. Вектор сконструирован на основе криптической плазмиды В. arayloliquefaciens. Вектор стабильно насл едуется без селективного давления,сохраняется у 100% клеток в течение 40 генерагщй, при включении в вектор фрагмента ДНК .размером 5,8 т.п.н. сохраняется у 100% клеток в течение 20 генераций.
(Л
Изобретение относится к биотехнологии и микробиологической промышленности и может быть использовано для создания промышленных продуцентов. Цель изобретения состоит в повышении стабильности наследования фрагментов ДНК в условиях отсутствия селективного давления. Получен вектор, способный реплицироваться в бациллах, в частности в B. SUBTILIS и в промышленных штаммах B. AMULOLIGUEFACIENS. Вектор сконструирован на основе криптической плазмиды B. AMYLOLIGUEFACIENS. Вектор стабильно наследуется без селективного давления, сохраняется у 100% клеток в течение 40 генераций, при включении в вектор фрагмента ДНК размером 5,8 т.п.н. сохраняется у 100% клеток в течение 20 генераций.
Изобретение относится к биотехнологии и микробиологической промышленности и может быть использовано. для. создания промышленных продуцентов ферментов, аминокислот, витаминов, применяемых в медицине, сельском хозяйстве, пищевой и легкой промьш- ленности.
Целью изобретения является повышение стабильности н аследования фрагментов ДНК в условиях отсутствия селективного давления.
Сконструированы на основе крип- тической плазмиды В. amyloliquif. рВА910 векторные плазмиды, содержащие следующие области: Pst 1 - Cla I фрагмент размером 2,0 т.п.н., где
расположена детерминанта устойчивости к эритромицину и область par, которая отвечает на стабильное наследование плазмиды РВА910, Cla f - Cla I - фрагмент размером 1,15 т.п.н, и Cla I - Pst 1 - фрагмент размером 1,25 т.п.н., отвечающие за репликап цию.
Пример 1. Плазмидную ДНК рВА910 обрабатьшают рестриктазой Taq I в условиях, обеспечивающих неполный гидролиз ДНК, для чего к 4 мкг ДНК в 50 мкл буфера, содержащего 10 мМ трис-HCl, рН 7,9, 10 MgCl, 10 мМ 2- -меркаптоэтанола 150 мМ NaCl, добавляют 1 ед. активности фермента Taq I, инкубируют в течеОй
l
00
ше 20 мин при 65°С, реакцию остана лрвают цобавлением 125 мкл 96%-ного эранола. После растнорення осадка в фдистиллированной воде получают на б|ор Taq 1-фрагментов ДНК рВА910 с различной степенью гидролиза. 5 мкг п|пазмиды рЕ194 серб обрабатывают Р стриктазой Taq I до полного гид- , Реакцию проводят, как описано выше, но к 5 мкг ДНК добавляют 1 Э ед. активности Taq I и инкубируют ачесь 60 мин при 65°С. Реакцию останавливают добавлением 125 мкл 96%- ного этанола. После растворения ДНК ТИ 1-фрагменты ДНК рВА910 и рЕ194 сорб смешивают в соотношении 1:1 ($ мкг РВА910 и 3 мкг рЕ194 сорб) и легируют в течение ночи в 50 мкл буфера, содержащего 6 мМ трис-НС1, РЧ 7,6, 6 мМ MgCl, 6 мМ 2- меркап- тфэтанола, 50 мМ NaCl. 0,5 мМ АТФ, 2(1 ед. активности ДНК-лигазы фага Т4 Пслученной смесью трансформируют -клеки В. subtilis SB 112, высевают их н L-arap с эритромицином (10 мкг/мл И: вьфосших клонов вьщеляют плазмид- Hbiie ДНК и анализируют их с помощь ю Рб стрикционного картирова 1ия. Кроме того, определяют стабильность наслет, дОвания полученных плазмид,, выявляют ст}абильно наследуемую плазмиду р1А6013, состоящую из нескольких Tsq 1-фрагментов, обладающую устойчивостью к эритромицину плазмиды рБ194 сорб и имеющую область репли- плазмиды рЕ194. С помощью ре- с1|рикционного анализа выявляют Msp I EcioR 1 - фрагмент плазмиды рВАбОТЗ, где расположены детерминанта устойчивости к эритромицину и область par отвечающая за стабильное Нс1следова- ние плазмиды рВА6013.
Для удобства манипулирования этим фрагментом и для дальнейшего использования его в качестве метчика крип- тйческих плазмид проводят ряд генно- инженерных манипуляций. 4 мкг ДНК РЙА6013 в 50 мкл буфера, содержащего 10 мМ трис-HCl, рН 7,4, 6 Ш MgCl, 6 мМ 2-А-меркаптоэтанола, 6 мМ КС1 и 8 ед. активности фермента Msp I, инкубируют 60 мин при в 50 мкл. Р«(акцию останавливают добавлением 125 мкл 96%-ного этанола. После растворения плазмидную ДНК обрабатывают р Ьстриктазой EcoR 1 в 50 мкл буфера, содержащего 100 мМ трис-HCl, рН 7, 10 мМ MgCl, 6 мМ 2-|Э-меркаптоэта
10
}5
0
5
0
нола, 50 мМ NaCl, Ю ед. активности EcoR 1. Реакцию останавливают, как описано выше.
Аналогично рестриктазами EcoR 1 и Асе 1 гидролизуют 5 мкг ДНК pUC19. Затем гидролизованные плазмидные ДНК смешивают в соотношении 1:1 и фер- ментативно сшивают ДНК-лигазой фага Т4. Полученной смесью трансформируют клетки E.coli TG-I, высевают их на L-arap с ампициллином (100 мкг/мл) выращивают при З7 с 16 ч и среди ампициллин-устойчивых клонов выявляют такие, которые содержит плазмиду с искомьм Msp I-EcoR 1-фрагментом. Такую плазмиду называют pUC19-11.
Затем проводят рестрикцию pUC19-11 и pBR322 рестриктазами Hind Щ и Pst 1, смешивают в соотношении 1:1, сшивают ДНК-лигазой фага Т4, легированной смесью трансформируют клетки E.coli TG-I, отбирают клоны, содержащие плазмиду с участком Pst 1 - Hind III из PBR322. Такую плазмвду называют pUC19-10. 5 мкг ДНК рВА910 и 5 мкг рис 19-10 обрабатывают рест- pиктaзoй.EcoR 1, сшивают с ДНК- лигазой фага Т4, полученной смесью трансформируют клетки В.subtilis SB112 и отбирают клоны, вырастаювде на L-arapе с эритромицином (10мкг/мп). Такие клоны содержат плазмиду рВА14, которая стабильно наследуется без селективного давления и придает клеткам устойчивость к эритромицину,
.1 мкг ДНК PUC19 и 2 мкг ДНК рВА14 инкубируют с рестриктазой Pst 1 в условиях, описанных выше, проводят ферментативное легирование полученных после рестрикции фрагментов. Ре- стрикцированную плазмидную ДНК смешивают в соотношении 1:10 (рис 19 : : рВА14); и сшивают в стандартных условиях. Полученной смесью транс формируют клетки E.coli, отбирают на L-arape с ампициллином (100 мкг/мл) клоны, содержащие бирепликонную плазмиду РВА14-9. Расщепление рВА14-9 рестриктазой E.coR 1, последующее легирование и трансформация В. subtilis SB112 позволяют выявить плазмиду рВА4.
5 мкг ДНК рВА4 обрабатывают рестриктазой EcoR 1 в следующих условиях: 100 1 трис-HCl, рН 7 5 Ш Ш MgClg, 6 2-й-меркапта- этанола, 50 мМ NaCl, 0,5 .ед. активности EcoR 1. Объем инкубационной
5 16
смеси 40 мкл. Инкубацию проводят при в течение 20 мин. Реакцию останавливают добавлением 100 мкл 96%- ного этанола. Затем ДНК перерастворяют в 20 мкл буфера ТЕ (10 м трис-HCl, рН 8,0, 0,1 мМ ЭДТА), вносят смесь дезокситрифосфатов до конечной концентрации 0,25 i кавдого. Объем доводят до 30 мкл буфером ТЕ и вносят 2 ед. активности кленовско- го фрагмента ДНК-полимеразы E.coli, Реакцию достройки липких концов проводят при комнатной температуре 30 мин и останавливают добавлением 75 мкл 96%-ного этанола. Осадок ДНК растворяют в 20 мкл раствора, содержащего 50 мМ трис-HCl, рН 7,5, 10 кй MgCl, 50 мМ NaCl, 0,5 мМ АТФ, и добавляют 20 ед. активности ДИК-лигазы фага Т4. Легирование проводят при 15°С в течение 4 ч. Полученную смесь путем трансформации вводят в B.subti- lis SBll2 и отбирают трансформированные бактерии после высева на ага- ризованную L-среду, содержащую 10 мкг/нл эритромицина. Анализ гшаз- мид, выделенных из эритромицин-устойчивых клонов, поз.воляет выявить ппаз- миды с одним участком узнавания ре- стриктазы EcoR 1.
Пример 2. Клонирование в плазмиде рВА48 фрагмента хромосомы с-геном Phe А В.amyloliquifaciens.
5 мкг ДНК рВА48 инкубируют при 37 С в течение 60 мин в буфере сле- дующего состава: 10 мМ трис-НС1, рН 7,6, 10 мМ MgClj,, 2-П-меркапто- этанол (6 мМ), 150 мМ NaCl, 10 ед. активности Pst 1. Реакцию останавли-. вают нагреванием при 65°С-в течение 25 мин. 5 мкг ДНК плазмиды рРНЕА32 инкубируют при в течение 20 мин в смеси, содержащей 10 мМ трис-НС1, рН 7,6, 10 мМ MgCl, 6 мМ 2-0-мер- каптозтанола, 150 i NaCl и 1 ед. активности Pst 1. Объем реакционной смеси 50 мкл. Реакцию останавливают прогреванием, как описано выше. Получают частично гидролизованную ДНК РРНЕА32. Гидролизованные ДНК рВА48 и рРНЕА32 смешивают в соотношении 3:1 (30 мкл рВА48 и 10 мкл рРНЕА32), добавляют АТФ до конечной концентрации 0,5 мМ и 25 ед. активности ДНК- лигазы фага Т4. Легирование проводят при комнатной температуре в течение 2 ч. Полученной смесью трансформиуют В. subtilis В 112, после чего
50
J5
6
высевают трансформированные кйетки на агаризованную среду Спицайзена, содержащую 0,4% глюкозы, 50 мкг/мп трип- тофана, 10 мкг/мп эритромицина. Фе- нилаланина селективная среда не содержит. После инкубации в течение 24-36 ч вырастают колонии. При анализе плазмидной ДНК, вьщеленной из обра- JQ зовавшихся колоний, выявлена плазмида рВА48-9, которая несет ген pheA B.amy- loliquefaciens и обеспечивает рост В. subtilis SB 112 на минимальной среде без фенилалгмина. 15рВА48-9 стабильно наследуется
в клетках Б. subtilis SB 112. 5 мкг ДНК рВА48 инкубируют при 37 С в течение 60 мин в 50 мкл буфера, содержащего 10 мМ трис-HCl, рН 7,9, 20 MgGl2, 6 мМ 2-/3-меркаптозтанола, 150 мМ NaCl и 10 ед. активности Ват HI. Реакцию останавливают добавлением 125 мкл 96%-ного этанола. ДНК перерастворяют в .буфере, содержащем 25 100 мМ трис-HCl, рН 7,5, 10 мМ MgClg, 6 мМ 2-/3-меркаптоэтанола, 50 мМ NaCl, добавляют 10 ед. активности EcoR 1 и инкубируют в течение 60 мин при 37 С. Реакцию останавливают как опи- 30 сано выше.
Аналогичным образом рестриктазами Ват HI и EcoR 1 обрабатывают ДНК pBR322. Гидролизованные, как описано выше,-ДНК рВА48 и pBR322 смеши- вают в соотношении 1:2 и легируют в стандартных условиях ДНК-лигазой фага Т4 в течение 2 ч. Полученной смесью трансформируют В. subtilis SB112. клетки после трансформации 40 высевают на агаризованную L-среду с эритромицином (10 мкг/мл). Из вы.- росших клонов вьщеляют плазмиды и с помощью рестрикционного анализа выявляют ппазг иду рВА91, где единичные 5 участки рестриктаз расположены в
следующем порядке: EcoR 1, Hind III, EcoR V, BamHI, Xba 1, Sac 1, Pst 1. ДНК pBA91 вводят в протопласты В.amy- loliquefaciens. 0
Пример 3. Проверка стабильности плазмиды рВА48.
Проверку стабильности наследова- ния штазмид проводят след ующим об- 5 разом. Штаммы В.subtilis SB112, со- держащие проверяемую штазмиду, рассевают на агаризованной 1,-среде с эритромицином до отдельных колоний и вьфащивают отдельную колонию в жидk
кой L-среде без эритромицина в течение 24 ч с интенсивной аэрацией. Затем в бактериальной культуре опреде- дяют титр бактерий на среде с эритро 1мицином и без него. Титры сравнивают и делают вывод о стабильности той |или иной плазмиды.
Пример 4. Стабильное подержание плазмиды рВА48 при клонйро- |вании в B.amyluliquefaciens. I Плазмиду рВА48 вводят в протоплас ;ты промышленного штамма В. amyloli- quefaciens А-50 известными методами После регенерации протопласты высе- |вают на агаризованную среду, содержащую 10 мкг/мп эритромицина. Стабильность плазмиды оценивают как описано выше. Плазмида стабильно наследуется без селективного давления и сохраняется у 100% клеток на протяжении 40 генераций.
Плазмиду рВА48-9 (пример 3) со- держащую ген фенилаланина, вводят в промышпенный штамм и анализируют стабильность наследов ания без селективного давления. На протяжении 20 генераций плазмида стабильно наследуется без селективного давления и сохраняется у 100% клеток.
Таким образом, плазмида рВА48 стабильно наследуется без селективного
0
5
0
5
0
давления в клетках бацилл у 100% клеток на протяжении 40 генераций, при встраивании в эту плазмиду фрагмента ДНК размером в 5,8 т.п.н. стабильность наследования сохраняется в отсутствии селективного давления у 100% клеток на протяжении 20 генераций.
Формула изобретения
Вектор рВА48, предназначенный для клонирования фрагментов ДНК в ба- циллах размером 4,4 т.п.н., содержащий - Pst 1 - Cla I - фрагмент ДНК размером 2,0 т.п.н. с геном устойчивости к эритромицину из рС194 и областью par, отвечающий за стабильное наследование из криптичес- крй плазмиды рВА 910J Cla I - Cla I - фрагмент ДНК плазмиды рВА 910 размером 1,15 T.n.H.J Cla 1 - EcoR 1 - фрагмент ДНК плазмиды рВА 910 разме- ром 1,2 т.п.н.; EcoR 1 - Pst 1 - фрагмент ДНК плазмиды pUC19 размером 0.05 т.п.н.J генетические маркеры: Em - ген устойчивости к эритромицину; уникальные сайты рестрикции : EcoR 1, Sac 1, Kpn 1, Sma 1, Bam HI, Xba 1, Pst 1J емкость - не менее 5,8 т.п.н.
