BRUCELLA SUIS BI-1-ДЕФИЦИТНЫЙ ШТАММ, СПОСОБ ЕГО КОНСТРУИРОВАНИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2022 года по МПК C12N1/21 C12N15/74 C12Q1/6876 A61K39/10 G01N33/569 

Настоящая заявка испрашивает приоритет китайской патентной заявки No. CN201911190912.9, поданной в Национальное ведомство интеллектуальной собственности Китая (CNIPA) 28 ноября 2019 года с названием «BI-1-дефицитный штамм Brucella suis, способ его конструирования и его применение», которая полностью включена в настоящее изобретение путём ссылки.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способу конструирования BI-1-дефицитного штамма Brucella suis и относится к области биотехнологии.

Уровень техники

Бруцеллез представляет собой зоонозное инфекционное заболевание, вызываемое бактериями рода Brucella, которое в основном вызывает аборты и бесплодие у пораженных животных и проявляется в основном волнообразной лихорадкой, остеоартритом и воспалением репродуктивной системы у людей. Это заболевание несет серьезную угрозу общественному здоровью и устойчивому развитию животноводства. Вакцинация является самым эффективным способом предотвращения бруцеллеза. Однако существующие вакцины все ещё имеют множество недостатков, таких как недостаточная иммунная защита и невозможность дифференцировать инфицированных животных от иммунизированных животных; более того, не существует эффективной вакцины против бруцеллеза человека. Поэтому крайне необходимы разработка вакцины против бруцеллеза и проведение связанных с этим исследований.

Brucella представляет собой род грамотрицательных, факультативных внутриклеточных бактерий, которые имеют форму палочки, не имеют капсул и жгутиков, не образуют спор и могут инфицировать профессиональные и непрофессиональные фагоциты. Brucella выработала множество факторов вирулентности и систем вирулентности. Попав внутрь клетки-хозяина, Brucella с помощью множества факторов вирулентности нарушает уничтожающий механизм иммунной системы хозяина и избегает распознавания им, а затем размножается внутриклетки и вызывает хроническую инфекцию. В многочисленных исследованиях сообщалось, что белки наружной мембраны (БНМ), липополисахарид (ЛПС), система секреции типа IV, кодирующая VirB, двухкомпонентная регуляторная система BvrR/BvrS, нуклеопротеин L7/L12, система чувства кворума являются важными факторами вирулентности, участвующими в вирулентности Brucella, большинство из которых обладают сильной иммунопротекторной активностью; кроме того, большинство компонентов представляют собой мембранные молекулы.

Ингибитор Bax-1 (BI-1) представляет собой высококонсервативный трансмембранный белок у эукариот и прокариот, который в основном играет роль в ингибировании апоптоза, вызванного BAX, у эукариот, но действует нечетко у прокариот. Однако было показано, что Escherichia coli BI-1-подобный белок YccA, является субстратом и регулятором АТФ-зависимой металлопротеиназы FtsH, которая играет важную роль в биосинтезе наружной мембраны бактерий. Исследование, проведенное авторами настоящего изобретения, показало, что дефицит BI-1 оказывает существенное влияние на рост и характеристики наружной мембраны Brucella, указывая на то, что BI-1-дефицитный штамм имеет потенциал для получения живых аттенуированных вакцин и разработки соответствующих методов обнаружения.

Сущность изобретения

Целью настоящего изобретения является получение штамма B. suis, дефицитного по ингибитору Bax-1 (BI-1), способ его конструирования и его применение. Техническая проблема, которую необходимо решить, состоит в том, чтобы удалить ген BI-1 из вакцинного штамма S2 B. suis, дополнительно ослабить вирулентность этого штамма и повысить его доступность и эффективность при создании вакцины и разработке подходящих методов обнаружения.

Для достижения вышеупомянутой цели настоящее изобретение предлагает следующие технические решения.

Настоящее изобретение относится к BI-1-дефицитному штамму Brucella suis, где этот штамм получен путём замены гена BI-1 Brucella suis геном устойчивости к канамицину; BI-1-дефицитный штамм Brucella suis депонирован в Китайском центре общемикробиологической коллекции культур (CGMCC) под регистрационным номером CGMCC No.18741.

Настоящее изобретение также относится к способу конструирования вышеупомянутого BI-1-дефицитного штамма Brucella suis, включающему в себя следующие этапы:

этап 1, дизайн требуемых праймеров для ПЦР на основе последовательности генома вакцинного штамма S2 Brucella suis, последовательности гена pEGFP-C1 и информации о сайтах рестрикции плазмиды pUC18;

этап 2, с использованием генома вакцинного штамма S2 Brucella suis в качестве матрицы, проведение ПЦР-амплификации для получения левого и правого гомологичных участков BI1-UP и BI1-DW, соответственно, гена BI-1; с использованием плазмиды pEGFP-C1 в качестве матрицы, проведение ПЦР-амплификации для получения гена устойчивости к канамицину KanR;

этап 3, раздельное лигирование фрагментов генов, полученных на этапе 2, в векторы pMD19T-simple для получения соответствующих рекомбинантных плазмид pMD19T-BI1-UP, pMD19T-BI1-DW и pMD19T-KanR;

этап 4, раздельная трансформация рекомбинантными плазмидами, полученными на этапе 3, компетентных клеток DH5α, отбор положительных трансформантов для культивирования, выделение и отправка соответствующих рекомбинантных плазмид в биотехнологическую компанию для секвенирования;

этап 5, выполнение двойной рестрикции рекомбинантных плазмид, правильно отсеквенированных на этапе 4, соответствующими эндонуклеазами рестрикции, соответственно, для выделения левого и правого гомологичных фрагментов гена BI-1 и фрагментов гена KanR;

этап 6, смешивание фрагментов генов, полученных на этапе 5, в равных объемах и лигирование этих фрагментов генов в вектор pUC18 для получения рекомбинантной плазмиды pUC18-BI1-KanR;

этап 7, получение компетентных клеток Brucella suis для использования;

этап 8, смешивание рекомбинантной плазмиды pUC18-BI1-KanR, полученной на этапе 6, с компетентными клетками, полученными на этапе 7, помещение на лед на 10 мин, перенос в предварительно охлажденную 1-миллиметровую кювету для электропорации и электропорация при 2,5 кВ в течение 4,5 мс; немедленное добавление 1 мл среды триптиказо-соевый бульон (TSB) без антибиотиков, и инкубирование при встряхивании 180 об/мин и температуре 37°C в течение 12 часов; посев на среду триптиказо-соевый агар (TSA) с добавлением 25 мкг/мл канамицина, инкубирование в течение 72 ч при температуре 37°C и отбор отдельных колоний для культивирования;

этап 9, термический лизис бактериальной суспензии, полученной на этапе 8, на водяной бане при температуре 70°C в течение 2 часов и использование праймеров BI1-F/R для ПЦР-идентификации для скрининга BI-1-дефицитного штамма.

Предпочтительно получение компетентных клеток Brucella suis включает в себя следующие этапы: нанесение штрихов вакцинного штамма S2 Brucella suis, хранящегося при температуре -80°C, на среду TSA без антибиотиков для восстановления, инокуляция отдельных колоний в 10 мл среды TSB без антибиотиков, культивирование в течение 48 часов при встряхивании 180 об/мин и температуре 37°C, а затем посев в 50 мл не содержащей антибиотиков среды TSB в объемном соотношении 1:100 для размножения культуры; когда значение ОD600 достигнет 0,9, предварительное охлаждение бактериальной суспензии на льду в течение 30 минут, центрифугирование в течение 20 минут при 4500 g и удаление супернатанта; ресуспендирование бактериальных клеток в 20 мл предварительно охлажденной ddH₂O, центрифугирование в течение 15 минут при 4500 g, удаление супернатанта и повторение этого этапа ещё один раз; ресуспендирование клеток в 20 мл предварительно охлажденного 10% водного раствора глицерина, центрифугирование в течение 15 минут при 4500 g, удаление супернатанта и повторение этого этапа ещё один раз; наконец, ресуспендирование бактериальных клеток в 1 мл предварительно охлажденного 10% водного раствора глицерина, распределение на аликвоты объемом 100 мкл и хранение при температуре -80°C до использования.

Предпочтительно праймеры для ПЦР, используемые на этапе 1, включают в себя:

Название праймера Последовательность праймера Сайт рестрикции Длина фрагмента No. праймера BI1-UF GCATGCCAGGTGACGGAGAACATT
Как показано в SEQ ID NO. 1 Sph I 1,176 п.н. P1 BI1-UR ACTAGTTGTGATTCATTATGGGGATTTC
Как показано в SEQ ID NO. 2 Spe I P2 BI1-DF GTCGACTGGGCAACCGTGAATAATC
Как показано в SEQ ID NO. 3 Sal I 1,093 п.н. P3 BI1-DR GAATTCAAGCGCAGCGAATGAAGAT
Как показано в SEQ ID NO. 4 EcoR I P4 KanR-F GTCGACTCAGGTGGCACTTTTCGGGGA
As shown in SEQ ID NO. 5 Sal I 1,375 п.н. P5 KanR-R ACTAGTTTGGGCGTCGCTTGGTCGGT
Как показано в SEQ ID NO. 6 Spe I P6 BI1-TF CAGCGTCGCCTTCATAGTA
Как показано в SEQ ID NO. 7 Нет 453 п.н. P7 BI1-TR CTTTCCAGCAGCTTCTTTTT
Как показано в SEQ ID NO. 8 Нет P8

Настоящее изобретение также относится к применению вышеупомянутого BI-1-дефицитного штамма Brucella suis для получения живой аттенуированной вакцины против Brucella.

Настоящее изобретение также относится к применению вышеупомянутого BI-1-дефицитного штамма Brucella suis для получения набора реагентов для обнаружения животных, инфицированных Brucella.

Предпочтительно набор реагентов дополнительно включает в себя реагент для обнаружения антител против BI-1.

Настоящее изобретение обладает следующими полезными эффектами:

Путём гомологичной рекомбинации в настоящем изобретении конструируется BI-1-дефицитный штамм Brucella suis и доказывается, что дефицит BI-1 будет значительно влиять на скорость роста и характеристики наружной мембраны клетки Brucella, так что у Brucella будет наблюдаться замедленный рост, усиленная агрегация бактериальных клеток и повышенная проницаемость. BI-1-дефицитный штамм B. suis, полученный в соответствии с настоящим изобретением, обеспечивает теоретическую и материальную основу для разработки новой живой аттенуированной вакцины против бруцеллеза и создания соответствующего метода его обнаружения; кроме того, этот штамм представляет собой теоретическую основу для исследования физиологических функций гена BI-1 у Brucella.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 иллюстрирует результат ПЦР левого и правого гомологичных участков гена BI-1;

М представляет собой ДНК-маркер DL5000, дорожка 1 представляет собой ПЦР продукт левого гомологичного участка гена BI-1 BI1-UP, а дорожка 2 представляет собой ПЦР продукт правого гомологичного участка гена BI-1 BI1-DW.

Фиг. 2 иллюстрирует результат ПЦР гена устойчивости к канамицину;

М представляет собой ДНК-маркер DL5000, а дорожка 1 представляет собой ПЦР продукт гена устойчивости к канамицину KanR.

Фиг. 3 иллюстрирует результат идентификации рестрикции pMD19T-BI1-UP;

M представляет собой ДНК-маркер DL5000, а дорожка 1 представляет собой результат двойной рестрикции pMD19T-BI1-UP рестриктазами Sph I и Spe I.

Фиг. 4 иллюстрирует результат идентификации рестрикции pMD19T-BI1-DW;

M представляет собой ДНК-маркер DL5000, а дорожка 1 представляет собой результат двойной рестрикции pMD19T-BI1-DW рестриктазами Sal I и EcoR I.

Фиг. 5 иллюстрирует результат идентификации рестрикции pMD19T-BI1-KanR;

M представляет собой ДНК-маркер DL5000, а дорожка 1 представляет собой результат двойной рестрикции pMD19T-BI1-KanR рестриктазами Sal I и Spe I.

Фиг. 6 иллюстрирует результат идентификации рестрикции рекомбинантной плазмиды pUC18-BI1-KanR;

M представляет собой ДНК-маркер DL5000, а дорожка 1 представляет собой результат двойной рестрикции pUC18-BI1-KanR рестриктазами Sph I и EcoR I.

Фиг. 7 иллюстрирует результат идентификации BI-1-дефицитного штамма B. suis;

М представляет собой ДНК-маркер DL5000, дорожка 1 представляет собой ПЦР продукт для идентификации вакцинного штамма S2 B. suis, а дорожка 2 представляет ПЦР собой продукт для идентификации BI-1-дефицитного штамма B. suis.

Фиг. 8 иллюстрирует результат обнаружения агрегации бактериальных клеток штамма B. suis с делецией гена BI-1;

A: суспензия живого вакцинного штамма S2 B. suis и суспензия BI-1-дефицитного штамма B. suis перед выдержкой, B: суспензия живого вакцинного штамма S2 B. suis и суспензия BI-1-дефицитного штамма B. suis через 24 часа после того, выдержки при комнатной температуре, C: агрегация бактериальных клеток, рассчитанная путём измерения оптической плотности при 600 нм (ОD600) суспензий обоих штаммов до и после выдержки.

Фиг. 9 показывает результат обнаружения скорости роста BI-1-дефицитного штамма B. suis.

Депонирование биологического материала

Штамм Brucella suis-ΔBI-1 был депонирован в Китайском центре общемикробиологической коллекции культур (CGMCC), Институт микробиологии Китайской академии наук, двор 3, NO. 1, West Beichen Road, район Чаоян, Пекин, Китай, 21 октября 2019 года под регистрационным номером CGMCC No.18741.

Подробное описание изобретения

Для ясного понимания технических характеристик настоящего изобретения, настоящее изобретение будет описано ниже в виде конкретного варианта его осуществления.

Предложен способ конструирования штамма B. suis с дефицитом ингибитора Bax-1 (BI-1), включающий в себя следующие конкретные этапы:

Этап 1, дизайн праймеров: на основе последовательности генома B. suis S2 был проведен дизайн праймеров для ПЦР для левого и правого гомологичных участков гена BI-1, BI1-UF/BI1-UR (содержащих сайты рестрикции Sph I и Spe I, соответственно) и BI1-DF/BI1-DR (содержащих сайты рестрикции Sal I и EcoR I, соответственно); на основе последовательности гена pEGFP-C1 был проведен дизайн праймеров для ПЦР для гена устойчивости к канамицину KanR-F/KanR-R (содержащих сайты рестрикции Sal I и Spe I, соответственно); кроме того, на основе последовательности генома B. suis S2 внутри последовательности гена BI-1 были сконструированы праймеры для идентификации дефицитного штамма BI1-TF/BI1-TR. Последовательности праймеров были следующими:

Название праймера Последовательность праймера Сайт рестрикции Длина фрагмента No. праймера BI1-UF GCATGCCAGGTGACGGAGAACATT
Как показано в SEQ ID NO. 1 Sph I 1,176 п.н. P1 BI1-UR ACTAGTTGTGATTCATTATGGGGATTTC
Как показано в SEQ ID NO. 2 Spe I P2 BI1-DF GTCGACTGGGCAACCGTGAATAATC
Как показано в SEQ ID NO. 3 Sal I 1,093 п.н. P3 BI1-DR GAATTCAAGCGCAGCGAATGAAGAT
Как показано в SEQ ID NO. 4 EcoR I P4 KanR-F GTCGACTCAGGTGGCACTTTTCGGGGA
Как показано в SEQ ID NO. 5 Sal I 1,375 п.н. P5 KanR-R ACTAGTTTGGGCGTCGCTTGGTCGGT
Как показано в SEQ ID NO. 6 Spe I P6 BI1-TF CAGCGTCGCCTTCATAGTA
Как показано в SEQ ID NO. 7 Нет 453 п.н. P7 BI1-TR CTTTCCAGCAGCTTCTTTTT
Как показано в SEQ ID NO. 8 Нет P8

Этап 2, получение целевых фрагментов: используя выделенный геном вакцинного штамма S2 B. suis в качестве матрицы, левый гомологичный участок гена BI-1, BI1-UP, был амплифицировано с использованием праймеров для ПЦР BI1-UF/BI1-UR, в то время как правый гомологичный участок гена BI-1, BI1-DW, амплифицировали с использованием праймеров для ПЦР BI1-DF/BI1-DR; Используя плазмиду pEGFP-C1 в качестве матрицы, фрагмент гена устойчивости к канамицину амплифицировали с использованием праймеров для ПЦР KanR-F/KanR-R. Полученные ПЦР-продукты BI1-UP, BI1-DW и KanR соответственно лигировали в вектор клонирования pMD19T-Simple для получения рекомбинантных плазмид pMD19T-BI1-UP, pMD19T-BI1-DW и pMD19T-KanR. Вышеупомянутыми рекомбинантными плазмидами трансформировали компетентные клетки DH5α посредством теплового шока, соответственно, и инкубировали в течение 1 ч при температуре 37°C и встряхивании 180 об/мин, после чего высевали на твердую среду LB с добавлением 60 мкг/мл ампициллина. Положительные трансформанты отбирали на следующий день и инкубировали в течение 16 ч при температуре 37°C и встряхивании 180 об/мин, после чего выделяли соответствующие рекомбинантные плазмиды. Выделенные рекомбинантные плазмиды pMD19T-BI1-UP, pMD19T-BI1-DW и pMD19T-KanR подвергали двойной рестрикции рестриктазами Sph I/Spe I, Sal I/EcoR I и Sal I/Spe I, соответственно, и правильно расщепленные и идентифицированные плазмиды отправляли в биотехнологическую компанию для секвенирования.

Этап 3, конструирование рекомбинантной плазмиды pUC18-BI1-KanR: рекомбинантные плазмиды, правильно отсеквенированные на этапе 2, pMD19T-BI1-UP, pMD19T-BI1-DW и pMD19T-KanR подвергали двойной рестрикции Sph I/Spe I, Sal I/EcoR I и Sal I/Spe I соответственно; расщепленные продукты подвергали электрофорезу в 1% агарозном геле и выделяли левый и правый гомологичные участки гена BI-1, BI1-UP и BI1-DW и фрагмент KanR гена устойчивости к канамицину, соответственно. Вышеупомянутые очищенные фрагменты генов смешивали в равных объемах и лигировали в плазмиду pUC18, которую подвергали двойной рестрикции рестриктазами Sph I/EcoR I в течение ночи при температуре 16°C, чтобы получить рекомбинантную плазмиду pUC18-BI1-KanR, дефицитную по BI-1. Вышеупомянутым продуктом лигирования трансформировали компетентные клетки DH5α посредством теплового шока и инкубировали в течение 1 ч при температуре 37°C и встряхивании 180 об/мин, после чего высевали на твердую среду LB с добавлением 25 мкг/мл канамицина. Положительный трансформант отбирали на следующий день и инкубировали в течение 16 ч при температуре 37°C и встряхивании 180 об/мин, после чего выделяли соответствующую рекомбинантную плазмиду. Выделенную плазмиду pUC18-BI1-KanR идентифицировали двойным расщеплением Sph I/EcoR I, и правильно идентифицированную плазмиду отправляли в биотехнологическую компанию для секвенирования.

Этап 4, приготовление компетентных клеток B. suis: вакцинный штамм S2 B. suis, хранящийся при температуре -80°C, наносили штрихами на среду триптиказо-соевый агар (TSA), не содержащую антибиотиков, для восстановления, и отдельные колонии отбирали и инокулируют в 10 мл среды триптиказо-соевый бульон (TSB) без антибиотика, культивированная в течение 48 часов при встряхивании 180 об/мин и 37°C, а затем инокулированная в 50 мл жидкой среды TSB без антибиотиков в объемном соотношении 1:100 для размножение культуры; когда значение ОD600 достигало 0,9, бактериальную суспензию предварительно охлаждали на льду в течение 30 минут и центрифугировали в течение 20 минут при 4500 g и температуре 4°C, а супернатант удаляли; бактериальные клетки ресуспендировали в 20 мл предварительно охлажденной ddH₂O, центрифугировали в течение 20 минут при 4500 g и температуре 4°C, супернатант отбрасывали и эту операцию повторяли ещё один раз; бактериальные клетки ресуспендировали в 20 мл предварительно охлажденного 10% водного раствора глицерина, центрифугировали в течение 15 минут при 4500 g и температуре 4°C, удаляли супернатант и повторяли эту операцию ещё один раз; наконец, бактериальные клетки ресуспендировали в 1 мл предварительно охлажденного 10% водного раствора глицерина, распределяли на аликвоты объемом 100 мкл и хранили при температуре ---80°C до использования.

Этап 5, скрининг и идентификация BI-1-дефицитного штамма B. suis: компетентные клетки, полученные на этапе 4, размораживали на льду, смешивали с 20 мкл pUC18-BI1-KanR, помещали на лед на 10 минут и переносили в предварительно охлажденную 1-миллиметровую кювету для электропорации и проводили электропорацию при 2,5 кВ в течение 4,5 мс; сразу после завершения электропорации добавляли 1 мл среды TSB без антибиотиков, инкубировали при встряхивании 180 об/мин и температуре 37°C в течение 12 часов, высевали на среду TSA с добавлением 25 мкг/мл канамицина и культивировали в течение 72 часов при температуре 37°C; одиночные колонии инокулировали в среду TSB в течение 48 часов при температуре 37°C и встряхивании 180 об/мин, и 1 мл бактериальной суспензии асептически пипетировали, подвергали термическому лизису на водяной бане при температуре 70°C в течение 2 часов и идентифицировали с помощью ПЦР с использованием идентифицирующих праймеров BI1-F/R. Поскольку дизайн идентифицирующих праймеров BI1-F/R осуществлен таким образом, что они находятся в гене BI-1, отсутствие ПЦР продукта на электрофорезе указывает на то, что ген BI-1 полностью заменен, что свидетельствует о получении BI-1-дефицитного штамма.

Пример конструирования рекомбинантной плазмиды

1. Дизайн праймеров

На основе последовательности генома B. suis S2 (регистрационный номер: NC_017251.1), опубликованной в базе данных NCBI, осуществляли дизайн праймеров для ПЦР-амплификации левого и правого гомологичных участков гена BI-1, BI1-UF/BI1-UR (содержащих сайты рестрикции Sph I и Spe I, соответственно) и BI1-DF/BI1-DR (содержащих сайты рестрикции Sal I и EcoR I, соответственно) и праймеров для идентификации мутантного штамма, расположенных внутри последовательности гена BI-1, BI1-TF/BI1-TR; на основе последовательности гена плазмиды pEGFP-C1 (регистрационный номер: U55763.1), опубликованной в базе данных NCBI, осуществляли дизайн праймеров для ПЦР-амплификации гена устойчивости к канамицину KanR-F/KanR-R (содержащих сайты рестрикции Sal I и Spe I, соответственно). Последовательности праймеров были следующими:

Название праймера Последовательность праймера Сайт рестрикции Длина фрагмента No. праймера BI1-UF GCATGCCAGGTGACGGAGAACATT
Как показано в SEQ ID NO. 1 Sph I 1,176 п.н. P1 BI1-UR ACTAGTTGTGATTCATTATGGGGATTTC
Как показано в SEQ ID NO. 2 Spe I P2 BI1-DF GTCGACTGGGCAACCGTGAATAATC
Как показано в SEQ ID NO. 3 Sal I 1,093 п.н. P3 BI1-DR GAATTCAAGCGCAGCGAATGAAGAT
Как показано в SEQ ID NO. 4 EcoR I P4 KanR-F GTCGACTCAGGTGGCACTTTTCGGGGA
Как показано в SEQ ID NO. 5 Sal I 1,375 п.н. P5 KanR-R ACTAGTTTGGGCGTCGCTTGGTCGGT
Как показано в SEQ ID NO. 6 Spe I P6 BI1-TF CAGCGTCGCCTTCATAGTA
Как показано в SEQ ID NO. 7 Нет 453 п.н. P7 BI1-TR CTTTCCAGCAGCTTCTTTTT
Как показано в SEQ ID NO. 8 Нет P8

2. Получение целевых фрагментов.

(1) ПЦР для левого и правого гомологичных участков гена BI-1 BI1-UP и BI1-DW

Используя геном живого вакцинного штамма S2 B. suis в качестве матрицы, проводили ПЦР с праймерами BI1-UF/ UR и BI1-DF/DR. Реакционная система была следующей: BI1-UF/DF 1 мкл, BI1-UR/DR 1 мкл, матрица 1 мкл, 2× Taq Mix 10 мкл и ddH₂O 7 мкл.

Условия реакции были следующими: 94°C в течение 5 мин; 30 циклов 94°C в течение 30 с, 54°C в течение 30 с и 72°C в течение 1,5 мин; 72 ° C в течение 10 мин.

После завершения ПЦР продукт ПЦР подвергали электрофорезу в 1% агарозном геле и вырезали специфичную целевую зону электрофоретической подвижности. Для очистки ПЦР продукта использовали набор реагентов для очистки TIANgel Midi Purification Kit (Tiangen Biotech (Beijing) Co., Ltd.) в соответствии с инструкциями производителя.

Результат показан на Фигуре 1. Одиночная зона имеет размер 1176 п.н. и 1093 п.н. соответственно, и молекулярные массы соответствуют ожиданиям.

(2) ПЦР на ген устойчивости к канамицину KanR

Используя плазмиду pEGFP-C1 в качестве матрицы, проводили ПЦР с праймерами KanR-F и KanR-R. Реакционная система была следующей: KanR-F 1 мкл, KanR-R 1 мкл, матрица 1 мкл, 2× Taq Mix 10 мкл и ddH₂O 7 мкл.

Условия реакции были следующими: 94°C в течение 5 мин; 30 циклов 94°C в течение 30 с, 60°C в течение 30 с и 72°C в течение 1,5 мин; 72°C в течение 10 мин.

После завершения ПЦР ПЦР продукт подвергали электрофорезу в 1% агарозном геле и вырезали специфичную целевую зону. Для очистки ПЦР продукта использовали набор реагентов для очистки TIANgel Midi Purification Kit (Tiangen Biotech (Beijing) Co., Ltd.) в соответствии с инструкциями производителя.

Результат показан на Фигуре 2. Одиночная зона имеет размер 1375 п.н., и молекулярная масса соответствует ожиданиям.

(3) Конструирование рекомбинантных плазмид pMD19T-BI1-UP, pMD19T-BI1-DW и pMD19T-KanR.

Лигазную смесь TAKARA использовали для лигирования BI1-UP, BI1-DW и KanR, выделенных и очищенных на этапах 1 и 2, в вектор pMD19T-Simple для получения рекомбинантных плазмид pMD19T-BI1-UP, pMD19T-BI1-DW и pMD19T-KanR соответственно. Реакционная система была следующей:

BI1-UP/BI1-DW/ KanR 1 мкл, pMD19T-Simple 1 мкл, лигазная смесь 5 мкл и ddH₂O 3 мкл.

Вышеуказанную реакционную систему инкубировали в течение ночи при температуре 16°C, трансформировали компетентные клетки DH5α, высевали на твердую среду LB с добавлением 60 мкг/мл ампициллина и культивировали в течение ночи при температуре 37°C. На следующий день отбирали отдельные колонии и культивировали в течение 16 ч при встряхивании 180 об/мин и температуре 37°C.

(4) Идентификация рекомбинантных плазмид pMD19T-BI1-UP, pMD19T-BI1-DW и pMD19T-KanR.

Для выделения плазмид из бактериальных суспензий, полученных на этапе 3, использовали набор реагентов TIANprep Mini Plasmid Kit (Tiangen Biotech (Beijing) Co., Ltd.) в соответствии с инструкциями производителя, соответственно, полученные рекомбинантные плазмиды pMD19T-BI1-UP, pMD19T-BI1-DW и pMD19T-KanR идентифицировали двойной рестрикцией, соответственно. Реакционная система была следующей:

i. pMD19T-BI1-UP 1 мкл, Sph I 0,3 мкл, Spe I 0,3 мкл, 10× H буфер 1 мкл и ddH₂O 7,4 мкл;

ii. pMD19T-BI1-DW 1 мкл, Sal I 0,3 мкл, EcoR I 0,3 мкл, 10× H буфер 1 мкл и ddH₂O 7,4 мкл;

iii. pMD19T-KanR 1 мкл, Sal I 0,3 мкл, Spe I 0,3 мкл, 10× H буфер 1 мкл и ddH₂O 7,4 мкл.

Вышеуказанную реакционную систему инкубировали в течение 2 ч при температуре 37°C и подвергалали электрофорезу в 1% агарозном геле. Результаты рестрикции наблюдали с помощью системы визуализации геля. Рекомбинантные плазмиды, правильно идентифицированные ферментным расщеплением, отправляли в биотехнологическую компанию для секвенирования.

Результаты показаны на Фигурах 3, 4 и 5. Специфичные зоны имеют размер 2694 п.н. и 1176 п.н., 2694 п.н. и 1093 п.н., 2694 п.н. и 1375 п.н. соответственно, что указывает на то, что рекомбинантные плазмиды были правильно лигированы.

(5) Получение фрагментов BI1-UP, BI1-DW и KanR

Рекомбинантные плазмиды pMD19T-BI1-UP, pMD19T-BI1-DW и pMD19T-KanR, правильно отсеквенированные на этапе 3, подвергали двойной рестрикции соответственно. Реакционная система была следующей:

i. pMD19T-BI1-UP 20 мкл, Sph I 1,5 мкл, Spe I 1,5 мкл, 10× H буфер 5 мкл и ddH₂O 22 мкл;

ii. pMD19T-BI1-DW 20 мкл, Sal I 1,5 мкл, EcoR I 1,5 мкл, 10× H буфер 5 мкл и ddH₂O 22 мкл;

iii. pMD19T-KanR 20 мкл, Sal I 1,5 мкл, Spe I 1,5 мкл, 10× H буфер 5 мкл и ddH₂O 22 мкл.

Вышеуказанную реакционную систему инкубировали в течение ночи при температуре 37°C и подвергали электрофорезу в 1% агарозном геле для вырезания специфичных целевых зон электрофоретической подвижности. Для очистки целевых зон использовали набор реагентов для очистки TIANgel Midi Purification Kit (Tiangen Biotech (Beijing) Co., Ltd.) в соответствии с инструкциями производителя, и таким образом получали левый и правый гомологичные участки гена BI-1, BI1-UP и BI1-DW, и ген устойчивости к канамицину KanR.

3. Конструирование рекомбинантной плазмиды pUC18-BI1-KanR.

Очищенные BI1-UP, BI1-DW и KanR смешивали в равных объемах и лигировали в вектор pUC18 с использованием лигазной смеси TAKARA для получения рекомбинантной плазмиды pUC18-BI1-KanR. Реакционная система была следующей: BI1-UP 2 мкл, BI1-DW 2 мкл, KanR 2 мкл, pUC18 1 мкл и лигазная смесь 7 мкл.

Вышеуказанную реакционную систему инкубировали в течение ночи при температуре 16°C, трансформировали компетентные клетки DH5α, высевали на твердую среду LB с добавлением 25 мкг/мл канамицина и культивировали в течение ночи при температуре 37°C. На следующий день отбирали отдельные колонии и культивировали в течение 16 ч при встряхивании 180 об/мин и температуре 37°C.

4. Идентификация рекомбинантной плазмиды pUC18-BI1-KanR

Для выделения плазмид из бактериальных суспензий, полученных на этапе 3, использовали набор реагентов TIANprep Mini Plasmid Kit (Tiangen Biotech (Beijing) Co., Ltd.) в соответствии с инструкциями производителя, и рекомбинантную плазмиду pUC18-BI1-KanR идентифицировали двойной рестрикцией. Реакционная система была следующей:

pUC18-BI1-KanR 1 мкл, Sph I 0,3 мкл, EcoR I 0,3 мкл, 10× H буфер 1 мкл и ddH₂O 7,4 мкл.

Вышеуказанную реакционную систему инкубировали в течение 2 ч при температуре 37°C и подвергали электрофорезу в 1% агарозном геле. Результаты рестрикции наблюдали с помощью системы визуализации геля. Рекомбинантные плазмиды, правильно идентифицированные ферментным расщеплением, отправляли в биотехнологическую компанию для секвенирования.

Результат показан на Фигуре 6. Специфичные зоны имеют размер 2645 п.н., 1479 п.н., 1308 п.н., 763 п.н. и 72 п.н. соответственно, что указывает на то, что рекомбинантная плазмида была правильно лигирована.

Получение компетентных клеток B. suis

(1) Вакцинный штамм S2 B. suis, хранящийся при температуре -80°C, наносили штрихами на среду TSA, не содержащую антибиотиков, для восстановлени и культивировали в течение 72 часов при температуре 37°C;

(2) Отдельные колонии отбирали и инокулировали в 10 мл среды TSB, не содержащей антибиотиков, и культивировали в течение 48 часов при встряхивании 180 об/мин и температуре 37°C;

(3) Вышеуказанную бактериальную суспензию инокулировали в 50 мл не содержащей антибиотиков среды TSB в объемном соотношении 1:100 и культивировали при встряхивании 180 об/мин и температуре 37°C до тех пор, пока значение ОD600 бактериальной суспензии не достигало 0,9;

(4) Вышеупомянутую бактериальную суспензию предварительно охлаждали на льду в течение 30 минут и центрифугировали в течение 20 минут при 4500 g и температуре 4°C, супернатант удаляли;

(5) Бактериальные клетки ресуспендировали в 20 мл предварительно охлажденной ddH₂O и центрифугировали в течение 15 минут при 4500 g и температуре 4°C, супернатант удаляли и эту операцию повторяли ещё один раз;

(6) Бактериальные клетки ресуспендировали в 20 мл предварительно охлажденного 10% водного раствора глицерина и центрифугировали в течение 15 минут при 4500 g и температуре 4°C, супернатант удаляли и эту операцию повторяли ещё один раз;

(7) бактериальные клетки ресуспендировали в 1 мл предварительно охлажденного 10% водного раствора глицерина; распределяли на аликвоты объемом 100 мкл и хранили при температуре -80°C до использования.

Скрининг и идентификация мутантного штамма B. suis с делецией гена BI-1

1. Электропорация компетентных клеток B. suis.

(1) Компетентные клетки B. suis извлекали из -80°C и размораживали на льду;

(2) 20 мкл рекомбинантной плазмиды pUC18-BI1-KanR пипетировали, смешивали с компетентными клетками и помещали на лед на 10 мин;

(3) Вышеуказанную смесь переносили в предварительно охлажденную 1-миллиметровую кювету для электропорации и подвергали электропорации при 2,5 кВ в течение 4,5 мс;

(4) немедленно добавляли 1 мл среды TSB без антибиотиков и инкубировали в течение 12 ч при 1встряхивании 80 об/мин и температуре 37°C;

(5) Вышеуказанный продукт трансформации высевали на среду TSA с добавлением 25 мкг/мл канамицина и культивировали в течение 72 часов при температуре 37°C;

(6) Отдельные колонии отбирали и инокулировали в 10 мл среды TSB и культивировали в течение 48 часов при встряхивании 180 об/мин и температуре 37°C;

(7) 1 мл вышеуказанной бактериальной суспензии асептически пипетировали и подвергали термическому лизису на водяной бане при температуре 70°C в течение 2 часов. Оставшуюся бактериальную суспензию временно хранили при температуре 4°C.

2. Идентификация мутантного штамма B. suis с делецией гена BI-1 с помощью ПЦР.

Используя суспензию убитых нагреванием бактерий на этапе 1 в качестве матрицы, использовали праймеры BI1-TF и BI1-TR для проведения ПЦР-идентификации образца бактериальной суспензии. Реакционная система была следующей:

BI1-TF 1 мкл, BI1-TR 1 мкл, матрица 1 мкл, 2× Taq Mix 10 мкл и ddH₂O 7 мкл;

Условия реакции были следующими:

94°С в течение 5 мин; 30 циклов 94°C в течение 30 с, 48°C в течение 30 секунд и 72°C в течение 30 секунд; 72°C в течение 10 мин.

После завершения указанной выше ПЦР продукты ПЦР подвергали электрофорезу в 1% агарозном геле, и результаты ПЦР наблюдали с помощью системы визуализации геля. К правильно идентифицированному BI-1-дефицитному штамму B. suis добавляли глицерин с конечной концентрацией 25% и хранили при температуре -80°C до использования.

Результат показан на Фигуре 7. Живой вакцинный штамм S2 B. suis имеет одну специфичную зону размером 453 п.н., а отобранный трансформант не имеет зон, что указывает на то, что отобранный трансформант представляет собой BI-1-дефицитный штамм B. suis.

Определение скорости роста мутантного штамма B. suis с делецией гена BI-1

(1) Вакцинный штамм S2 B. suis и мутантный штамм ΔBI-1 B. suis с делецией гена BI-1, хранившиеся при температуре -80°C, наносили штрихами на среду TSA, не содержащую антибиотиков, и среду TSA с добавлением 25 мкг/мл канамицина для восстановления и культивировали в течение 72 ч при температуре 37°C, соответственно;

(2) Отдельные колонии отбирали и инокулировали в 10 мл среды TSB без антибиотиков и среды TSB с добавлением 25 мкг/мл канамицина и культивировали в течение 48 часов при встряхивании 180 об/мин и температуре 37°C, соответственно;

(3) Вышеуказанные бактериальные суспензии центрифугировали в течение 10 минут при 5000 g и температуре 4°C, и бактериальные клетки ресуспендировали в 10 мл стерильного ФСБ;

(4) Вышеуказанные бактериальные суспензии разводили в 10, 10², 10³, 104, 10⁵, 10⁶, 10⁷ и 10⁸ раз стерильным ФСБ, высевали на среду TSA, не содержащую антибиотиков, и культивировали в течение 72 ч при температуре 37°С соответственно; подсчитывали колонии для определения концентраций двух бактериальных суспензий;

(5) Две вышеупомянутые бактериальные суспензии с одинаковым количеством бактерий пипетировали, инокулировали в не содержащую антибиотиков среду TSB, культивировали при встряхивании 180 об/мин и температуре 37°C, соответственно; оптическую плотность бактериальных суспензий при измеряли при длине волны 600 нм для определения скорости роста двух штаммов через 0, 8, 16, 24, 32, 40 и 48 ч после инокуляции, соответственно.

Результаты показаны на Фигуре 9. По сравнению с живым вакцинным штаммом S2 B. suis, скорость роста BI-1-дефицитного штамма B. suis значительно замедляется.

Определение агрегации бактериальных клеток мутантного штамма B. suis с делецией BI-1

(1) Вакцинный штамм S2 B. suis и мутантный штамм ΔBI-1 B. suis с делецией гена BI-1, хранившиеся при температуре -80°C, наносили штрихами на среду TSA, не содержащую антибиотиков, и среду TSA с добавлением 25 мкг/мл канамицина для восстановления и культивировали в течение 72 ч при температуре 37°C соответственно;

(2) Отдельные колонии отбирали и инокулировали в 10 мл среды TSB без антибиотиков и среды TSB с добавлением 25 мкг/мл канамицина и культивировали в течение 48 часов при встряхивании 180 об/мин и температуре 37°C, соответственно;

(3) 1 мл каждой из вышеупомянутых бактериальных суспензий асептически пипетировали и подвергали термическому лизису на водяной бане при температуре 70°C в течение 2 часов; Для измерения оптической плотности при длине волны 600 нм отбирали по 150 мкл каждой из суспензий убитых нагреванием бактерий;

(4) После асептического внесения 1 мл каждой бактериальной суспензии оставшиеся бактериальные суспензии оставляли на 24 часа при комнатной температуре; Пипеткой отбирали по 1 мл каждого супернатанта и термически инактивировали на водяной бане при температуре 70°C в течение 2 часов; аналогичным образом по 150 мкл каждой из суспензий убитых нагреванием бактерий отбирали для измерения оптической плотности при длине волны 600 нм;

(5) Агрегацию бактериальных клеток двух штаммов рассчитывали по следующей формуле.

Агрегация клеток (%) = ([ОD_{Интактных бактерий} - ОD_{супернатанта}] / ОD_{Интактных бактерий}) × 100

Результаты показаны на Фигуре 8. По сравнению с живым вакцинным штаммом S2 B. suis, агрегация клеток штамма B. suis с делецией гена BI-1 значительно усиливается, что указывает на то, что характеристики наружной клеточной мембраны у дефицитного штамма значительно изменяются.

BI-1-дефицитный штамм B. suis в настоящей заявке представляет собой Brucella suis-ΔBI-1, и этот штамм Brucella suis-ΔBI-1 был депонирован. Депозит биологического материала выглядит следующим образом:

Дата депонирования: 21 октября 2019 года;

Полное наименование депозитария: Китайский центр общемикробиологической коллекции культур (China General Microbiological Culture Collection Center);

Аббревиатура депозитария: CGMCC;

Адрес депозитария: Институт микробиологии Китайской академии наук, двор 3, NO. 1, West Beichen Road, район Чаоян, Пекин, Китай;

Регистрационный номер: CGMCC No.18741;

Таксономическое наименование: Brucella suis.

Вышеприведенное описание является только предпочтительным примером настоящего изобретения; Следует отметить, что ряд улучшений и модификаций также могут быть выполнены специалистами в данной области техники без отклонения от принципов настоящего изобретения, и эти улучшения и модификации также следует рассматривать как включенные в объем защиты настоящего изобретения.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> НОРСУЭСТ А&Ф ЮНИВЁРСИТИ

<120> BI-1-дефицитный штамм Brucella suis, способ его конструирования

и его применение

<160> 8

<170> SIPO список последовательностей 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 1

gcatgccagg tgacggagaa catt 24

<210> 2

<211> 28

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 2

actagttgtg attcattatg gggatttc 28

<210> 3

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 3

gtcgactggg caaccgtgaa taatc 25

<210> 4

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 4

gaattcaagc gcagcgaatg aagat 25

<210> 5

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 5

gtcgactcag gtggcacttt tcgggga 27

<210> 6

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 6

actagtttgg gcgtcgcttg gtcggt 26

<210> 7

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 7

cagcgtcgcc ttcatagta 19

<210> 8

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 8

ctttccagca gcttcttttt 20

<---

Группа изобретений относится к BI-1-дефицитному штамму Brucella suis и способу его конструирования. Предложен BI-1-дефицитный штамм B. suis для замедления скорости роста и усиления агрегации клеток B. suis, при этом указанный штамм получен путем замены гена BI-1 B. suis геном устойчивости к канамицину. Указанный штамм депонирован в Китайском центре общемикробиологической коллекции культур (CGMCC) под регистрационным номером CGMCC No.18741. Предложен также способ получения указанного штамма, включающий следующие этапы: использование генома вакцинного штамма S2 B. suis в качестве матрицы, выполнение ПЦР-амплификации для получения левого и правого гомологичных участков гена BI-1 и клонирование этих левого и правого гомологичных участков в плазмиду pUC18 вместе с фрагментом гена устойчивости к канамицину, полученным с помощью ПЦР-амплификации, для получения рекомбинантной плазмиды pUC18-BI1-KanR. Полученную плазмиду вводят путём электропорации в компетентные клетки B. suis, и положительный трансформант идентифицируют с помощью ПЦР как BI-1-дефицитный штамм B. suis. По сравнению со штаммом дикого типа предложенный штамм отличается медленной скоростью роста, уменьшенным количеством колоний, повышенной проницаемостью мембран и усиленной агрегацией клеток. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 9 ил., 1 табл., 1 пр.

1. BI-1-дефицитный штамм Brucella suis для замедления скорости роста и усиления агрегации клеток Brucella suis, где указанный штамм получен путем замены гена BI-1 Brucella suis геном устойчивости к канамицину; BI-1-дефицитный штамм Brucella suis депонирован в Китайском центре общемикробиологической коллекции культур (CGMCC) под регистрационным номером CGMCC No.18741.

2. Способ конструирования BI-1-дефицитного штамма Brucella suis по п.1, включающий в себя следующие этапы:

этап 1 - дизайн требуемых праймеров для ПЦР на основе последовательности генома вакцинного штамма S2 Brucella suis, последовательности гена pEGFP-C1 и информации о сайтах рестрикции плазмиды pUC18;

этап 2 - с использованием генома вакцинного штамма S2 Brucella suis в качестве матрицы проведение ПЦР-амплификации для получения левого и правого гомологичных участков BI1-UP и BI1-DW соответственно гена BI-1; с использованием плазмиды pEGFP-C1 в качестве матрицы проведение ПЦР-амплификации для получения гена устойчивости к канамицину KanR;

этап 3 - раздельное лигирование фрагментов генов, полученных на этапе 2, в векторы pMD19T-simple для получения соответствующих рекомбинантных плазмид pMD19T-BI1-UP, pMD19T-BI1-DW и pMD19T-KanR;

этап 4 - раздельная трансформация рекомбинантными плазмидами, полученными на этапе 3, компетентных клеток DH5α, отбор положительных трансформантов для культивирования, выделение и отправка соответствующих рекомбинантных плазмид в биотехнологическую компанию для секвенирования;

этап 5 - выполнение двойной рестрикции рекомбинантных плазмид, отсеквенированных на этапе 4, соответствующими эндонуклеазами рестрикции соответственно для выделения левого и правого гомологичных фрагментов гена BI-1 и фрагментов гена KanR;

этап 6 - смешивание фрагментов генов, полученных на этапе 5, в равных объемах и лигирование этих фрагментов генов в вектор pUC18 для получения рекомбинантной плазмиды pUC18-BI1-KanR;

этап 7 - получение компетентных клеток Brucella suis для использования;

этап 8 - смешивание рекомбинантной плазмиды pUC18-BI1-KanR, полученной на этапе 6, с компетентными клетками, полученными на этапе 7, помещение на лед на 10 мин, перенос в предварительно охлажденную 1-миллиметровую кювету для электропорации и электропорация при 2,5 кВ в течение 4,5 мс; немедленное добавление 1 мл среды триптиказо-соевый бульон (TSB) без антибиотиков и инкубирование при встряхивании 180 об/мин и температуре 37°C в течение 12 часов; посев на среду триптиказо-соевый агар (TSA) с добавлением 25 мкг/мл канамицина, инкубирование в течение 72 ч при температуре 37°C и отбор отдельных колоний для культивирования;

этап 9 - термический лизис бактериальной суспензии, полученной на этапе 8, на водяной бане при температуре 70°C в течение 2 часов и использование праймеров BI1-F/R для ПЦР-идентификации для скрининга BI-1-дефицитного штамма.

3. Способ конструирования BI-1-дефицитного штамма Brucella suis по п.2, где получение компетентных клеток Brucella suis включает в себя следующие этапы: нанесение штрихов вакцинного штамма S2 Brucella suis, хранящегося при температуре -80°C, на среду TSA без антибиотиков для восстановления, инокуляция отдельных колоний в 10 мл среды TSB без антибиотиков, культивирование в течение 48 часов при встряхивании 180 об/мин и температуре 37°C, а затем посев в 50 мл не содержащей антибиотиков среды TSB в объемном соотношении 1:100 для размножения культуры; когда значение ОD600 достигнет 0,9, предварительное охлаждение бактериальной суспензии на льду в течение 30 минут, центрифугирование в течение 20 минут при 4500 g и удаление супернатанта; ресуспендирование бактериальных клеток в 20 мл предварительно охлажденной ddH₂O, центрифугирование в течение 15 минут при 4500g, удаление супернатанта и повторение этого этапа еще один раз; ресуспендирование клеток в 20 мл предварительно охлажденного 10% водного раствора глицерина, центрифугирование в течение 15 минут при 4500g, удаление супернатанта и повторение этого этапа еще один раз; наконец, ресуспендирование бактериальных клеток в 1 мл предварительно охлажденного 10% водного раствора глицерина, распределение на аликвоты объемом 100 мкл и хранение при температуре -80°C до использования.

4. Способ конструирования BI-1-дефицитного штамма Brucella suis по п.2 или 3, где праймеры для ПЦР, используемые на этапе 1, включают в себя:

BI1-UF с последовательностью праймера GCATGCCAGGTGACGGAGAACATT (приведенной в SEQ ID NO: 1) и сайтом рестрикции Sph I;

BI1-UR с праймерной последовательностью ACTAGTTGTGATTCATTATGGGGATTTC (приведенной в SEQ ID NO. 2) и сайтом рестрикции Spe I;

BI1-DF с последовательностью праймера GTCGACTGGGCAACCGTGAATAATC (приведена в SEQ ID NO. 3) и сайтом рестрикции Sal I;

BI1-DR с последовательностью праймера GAATTCAAGCGCAGCGAATGAAGAT (приведенной в SEQ ID NO: 4) и сайтом рестрикции EcoR I;

KanR-F с последовательностью праймера GTCGACTCAGGTGGCACTTTTCGGGGA (приведена в SEQ ID NO. 5) и сайтом рестрикции Sal I;

KanR-R с последовательностью праймера ACTAGTTTGGGCGTCGCTTGGTCGGT (приведена в SEQ ID NO. 6) и сайтом рестрикции Spe I;

BI1-TF с последовательностью праймера CAGCGTCGCCTTCATAGTA (приведенной в SEQ ID NO. 7) и без сайта рестрикции;

BI1-TR с праймерной последовательностью CTTTCCAGCAGCTTCTTTTT (приведенной в SEQ ID NO. 8) и без сайта рестрикции;

BI1-UF и BI1-UR могут продуцировать фрагменты ДНК длиной 1176 п.н., BI1-DF и BI1-DR могут производить фрагменты ДНК длиной 1093 п.н., KanR-F и KanR-R могут производить фрагменты ДНК длиной из 1375 п.н., BI1-TF и BI1-TR могут продуцировать фрагменты ДНК длиной 453 п.н.