Способ определения креатинина в сыворотке крови Советский патент 1985 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине а именно к способу для специфическ го ферметативного определения креатинина. Известе-н способ определения креа тинина путем смешивания креатинина с щелочным пикратом il . Однако данный способ является недостаточно специфическим при выяв лении креатинина в сыворотке крови Цель изобретения - повышение специфичности способа. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения креатинина к пробе добавляют кр атининаминогидролазу, инкубируют при рН 7,8-8,3 в течение 45-60 мин при 37 С и по уровню уменьшающегося креатинина или образовавшегося креатинина определяют креатинин в пробе. Способ осуществляют следующим образом. Фермент - креатининаминогидролаз получают по известному методу. Этот фермент катализирует реакцию : КреатинамидогидролазаКреатинин+Н-рО у . : Креатин Образовавшийся креатин можно измерить известными способами, например, фосфорилированием креатиновой киназой и аденозинтрифосфатом (АТФ с образованием адёнозиндифосфата. Другая возможность состоит в измерении уменьшения количества креатинина по Жафе. Способ осуществляют при рН между 7,8 и 8,3. Для установки величины рН можно применять любые буферные растворы. Однако следует обращать внимание на то, чтобы применяемый буфер не препятствовал используемом методу определения. Если, например затем по Жафе определяют изменение содержания креатинина, нужно применить буфер, который не подавляет реакцию Жафе. Неблагоприятные для реакции, например, глициновые и гли цилглициновые буферные растворы. Предпочтительными являются фосфатны и пирофосфатные буферы. Однако если определение производится не по Жафе а образовавщийся креатин определяют с помощью креатиновой киназы и АТФ .то можно применять также глициновые и им подобные буферные растворы. 9J Согласно предлагаемому способу предварительное отделение белка не требуется. Однако отделение белка целесообразно для последующего определения креатина. Креатин переводят при применении фермента креатиназы в саркозин и мочевину и последнюю определяют с помощью известных методов. Этот вид осуществления способа применяется для определения фермента, содержащего креатинкиназу и креатиназу в смеси. Если образовавшийся креатин определяют известным способом с применением креатиназы и АТФ, то отделение белка выгодно, так как благодаря этому повышается чувствительность теста. Применение фермента, содержащего креатинамидогидролазу и креатиназу, предпочтительно, когда определение креатинина производится по Жафе, так как благодаря креатиназе равновесие перемещается в сторону образовання креатина. Изобретение создает также новую комбинацию реактивов для специфического определения креатинина, которая состоит из креатинового стандарта, пикриновой кислоты, едкого натра, креатининамидогидролазы (одной или вместе с буфером), а также в том или ином случае креатиназы, в не смешиваемом до употребления состоянии. Кроме того, комбинация состоит из буфера, восстановленного никотинамид-аденин-динуклеотида(NADN), АТР и фосфоенолпирувата (ФЕП): лактатдегидрогенозы (LDH), пируваткиназы (РК) и MgC ; креатинкиназы (СК), креатининамидогидролазы в не смешиваемом до употребления состоянии, 1 П р и м е р 1. Определение с непосредственно/ следующим применением реакции Жафе, 1,0 мл содержащей креатинин пробы (сыворотка или разбавленная моча) инкубируют в 0,050-0,2 М буфера (особенно пригодны пирофосфатный, фосфатный, диэтаноламии) HCR, или глицилглицин (НСЕ - буфер) креатининамидогидролазой в количестве минимум 5 и (тест), 1 U 1 ммоль, превращенного субстрата за 1 мин и креатиназой в количестве минимум 0,8 и (тест) при З7с в течение 45360 мин. Затем производят отделение белка с помощью 3 М трихлоруксусной кислоты вместе с пробой, к которой не прибавляют смеси ферментов. В на досадочной жидкости обеих проб прово дят реакцию Жафе. Из разности экстинкций обеих проб при 546nm получается количество креатинина по отно шению к стандартной величине креатинина. Реакцию окрашивания по Жафе проводят путем добавления пикриновой кислоты и NaOH, выдержки в течение 15 мин при комнатной температуре и измерения и кювете с толщиной слоя 2 см при 546 . П р и м е р 2. Измерение креатина с помощью креатинкиназы. С помощью креатинкиназы креатинин гидролизуется в креатин и образовавшийся креатин фосфорилируется по известной методике креатинкиназой и АТФ. Образовавшийся АБФ превращается посредством ФЕК и ПК в АТФ и при этом получившийся пируват восстанавливается посредством NADH и лактатдегидрогеназы в лактат при 294 об1эазовании NAD. Обмен 1 ммоль NADH, измерение при 334, 340 или 366 п m (соответствует присутствию 1 ммоль креатинина). определения смесь реактивов, содержащая NADH, ATP, PEP и хлорид магния в 0,11 М буфера при рН 9,0 смешивают с лактатдегидрогеназой (LDH), пируваткиказой (РК) и термостатируют до . Затем добавляют сыворотку и креатинкиназу, и при указанной температуре производят инкубирование максимум в течение 30 мин. Путем добавления минимум 5 U креатинкиназы начинают реакцию. Падение экстинкции регистрируют. Продолжительность реакции составляет 40- 90 мин. Содержание креатина вычисляют непосредственно по молярным коэффициентам экстинкции NADH. Преимуществом данного способа является повышение специфичности определения креатинина, упрощение по сравнению с базовым способом, отсутствие необходимости отделения белка в сыворотке крови.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КРЕАТИНИНА В СЬгаОРОТКЕ КРОВИ, о т л ич а ю щ и и с я тем, что, с целью повьшения специфичности способа, к пробе добавляют гфеатининаминогвдролазу, инкубируют при рН 7,8-8,3 в течение 45-60 мин при 37°С и по уровню уменьшакщегося креатинина или образовавшегося креатина определяют креатинин в пробе. i w