Способ экспресс-диагностики сифилиса Советский патент 1993 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к иммунологии и касается серологических способов исследования.

В последние годы возросла потребность в более широком охвате населения серологическими исследованиями на сифилис при профосмотрах, массовом обследовании доноров, беременных, больных инфекционными заболеваниями в стационарах, в гематологической и хирургической практике. Так, большое распространение за рубежом получили микроосадочные реакции с кардиолипйновым антигеном и сыворотной крови больного - тест ДР1 л его модификации касались сыворотки и крови больных - активная или инактивная сыворотка, плазма крови, нативная кровь из пальца, но при всех модификациях в качестве антигена использован кардиолипин.

Начиная с 1978 года, при массовых обследованиях на сифилис больших групп населения в нашей стране все чаше используется микрореакция с кардиолипйновым антигеном.

Однако общепризнано, что микрореакция чаще, чем другие реакции на сифилис,

может давать ложноположительные результаты. В связи с этим она и называется ориентировочным (отборочным) тестом.

Наиболее близким (прототип) по своей сущности к предлагаемому изобретению является кардиолипиновый антиген, утвержденный МЗ СССР для реакции микропреципитации на предметном стекле для серологического обследования на сифилис, представляющий собой раствор липи- дов и холестерина в абсолютном этаноле.

Однако данный антиген является неспецифическим, в связи с чём он дает определенное количество неспецифических результатов.

Цель предлагаемого изобретения - повышение чувствительности способа.

Способ осуществляют следующим образом.

. Готовят масляный специфический антиген из озвученного культурального трепо- немного антигена (Ставропольский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток) для РСК по методике приготовления масляного антигена для реакции агломерации - одной из реакций моV

О

3

Ov XI

несистемного иммунологического метода. Адсорбентом специфического антигена служат частицы масляной эмульсии, полученные из оливкового масла (или подсолнечного) Разбавителем является физиологический раствор поваренной соли (0,85%), в качестве эмульгатора используется 5%-ный р-р буры. Для этих целей в колбу с 20 мл физраст- вора добавляют 1,3 мл оливкового масла и 3-5 капель 5%-ного раствора буры. Смесь энергично встряхивают руками в течение 10 мин. Полученную мелкодисперсную эмульсию используют в дальнейшей работе.

Для проведения сенсибилизации к to мг сухого коммерческого трепонемного озвученного антигена (во флаконе) добавляют 5 мл физиологического раствора,встряхивают до полного растворения и оставляют на 5 мин при комнатной температуре. Затем равные объемы приготовленной масляной эмульсии и растворенного трепонемного озвученного антигена в физиологическом растворе смешивают встряхиванием в пробирке в течение 2-3 мин. Приготовленная смесь выдерживается при комнатной температуре до 30 мин. После этого антиген используют в реакции.

Масляный трепонемный озвученный антиген не теряет своих свойств при хранении в холодильнике(при 3-5 С)в течение 10 дней (срок наблюдения).

8 реакции микропреципитации на стекле используют инактивированную сыворотку крови людей в разведении 1:5.

На предметное стекло с лунками или полистироловую пластинку опыт и контроль наносят по 1 капле масляного трепонемного озвученного антигена. В опытную лунку добавляют 1 каплю исследуемой сыворотки (1:5) и перемешивают стеклянной палочкой, в контрольную лунку 1 каплю физиологического раствора или i каплю сыворотки крови донора (заведомо отрицательную) в -разведении 1:5 и также сразу перемешивают стеклянной палочкой. Через 3-5 минут учитывают реакцию. Для лучшей видимости преципитации можно использовать черный фон.

Положительной реакцией (опыт) считают образование четко ограниченного преципитата в центре капли; по периферии капли наблюдается просветление.

При отрицательной реакции (контроль) капля остается гомогенно-мутной.

Возможность использования в диагностическом тесте (ДТ) на сифилис масляного трепонемного озвученного антигена поясняется в примерах исследования сывороток крови людей больных сифилисом, обследующихся на сифилис больных другими заболеваниями несифилитической этиологии и практически здоровых людей - доноров.

Результаты ДТ сравнивали с микрореакцией на стекле с кардиолипиновым антигеном,

применяющимся для экспресс-диагностики сифилиса (ЭД С), с результатами стандартного комплекса серологических реакций на сифилис (КСР) и реакции иммунофлуоресценции (РИФ, непрямой метод), которую ставили для

0 уточнения результатов исследования некоторых сывороток.

Способ поясняют следующими примерами.

Пример 1, 100 сывороток крови

5 людей с установленным диагнозом различных форм сифилиса инактивировали на водяной бане при 56 °С в течение 30 мин. Для каждой испытуемой сыворотки готовили разведение 1:5 в пробирке (такое разведе0 ние сыворотки используется для постановки РСК). На предметное стекло наносили 1 каплю готового масляного трепонемного антигена и 1 каплю исследуемой сыворотки больного (Опыт). Рядом, для Контроля,

5 к 1 капле масляного трепонемного антигена добавляли 1 каплю физиологического раствора. Стеклянной палочкой тщательно перемешивали капли.

Через 3-5 мин учитывали реакцию. Для

0 лучшей видимости преципитации можно использовать черный фон. Положительная реак- . ция появилась образованием ограниченного преципитата в центре капли; по периферии капли наблюдалось просветление. В Крнтро5 ле капля осталась гомогенно-мутной.

Положительные результаты в ДТ получены с 91 сывороткой, в ЭДС с кардиолипиновым с 86, в КСР - с 87. Расхождения в результатах исследования сывороток этой

0 группы составили 5 сывороток в пользу ДТ, Эти сыворотки принадлежали людям с установленным диагнозом сифилиса.

П р и м е р 2. Исследование группы сывороток от людей, обследующихся на си5 фи лис по различным причинам (для снятия с учета после проведенного лечения, контактные люди, подозрение на сифилис ввиду наличия клинических признаков и т.д.) в количестве 58, проводили по предложенной

0 методике: на предметном стекле 1 каплю масляного трепонемного антигена тщательно смешивали с 1 каплей исследуемой сыворотки стеклянной палочкой; контролем служила капля масляного трепонемного ан5 тигеяа и капля физиологического раствора. Учет результатов проводили через 3-5 минут. Положительные результаты в диагностическом тесте с масляным трепонемным антигеном получены с 37 сыворотками, в экспресс-диагностике с кардиолипиновым

антигеном -с 26, в КСР - с 26. Расхождения в результатах исследования по разным серологическим тестам были получены с 11 сыворотками. В ЭДС и КСР. У шести больных с клиническими проявлениями, сыворотки которых входят в группу давших расхождения в результатах исследования, в дальнейшем (по клиническим данным эрозивный твердый шанкр)установлен диагноз первичного активного и вторичного рецидивного сифилиса и в РИФ был получен положительный результат.

С тремя сыворотками людей, больных сифилисом, прошедших курс лечения и снимающихся с учета, получены положительные результаты не только в диагностическом тесте с масляным трепонемным антигеном, но и в РИФ, при отрицательных результатах КСР и ЭДС. Учитывая чувствительность и специфичность РИФ, можно положительные результаты с ДТ вышеуказанными сыворотками считать подтверждающими чувствительность масляного трепонемного антигена.

Больные, с сыворотками которых получены положительные результаты только в ДТ с масляным трепонемным антигеном при отрицательных результатах в других серологических тестах, требуют более глубокого обследования и дальнейшего наблюдения.

Пример 3. С сывороткой больного А-ва A.M. с диагнозом: эрозивный белано- постит получены отрицательные результаты и в комплексе серологических реакций и в ЭДС с кардиолипиновым антигеном. В диагностическом тесте на стекле с масляным трепонемным антигеном и в РИФ был получен положительный результат. В дальнейшем данному больному был поставлен диагноз первичного активного сифилиса.

Пример А. Сыворотка больного М-ва С.Н, с диагнозом первичного активного сифилиса, прошедшего курсы лечения и снимающегося с учета, дала положительный результат в ДТ с масляным трепонемным антигеном и в РИФ при отрицательных результатах в КСР и ЭДС с кардиолипиновым.

Пример 5. Исследование сывороток крови людей с заболеваниями несифилитической этиологии (гонорея, кожные болезни и др.) в количестве 24 в диагностическом тесте на стекле выявляет достаточную специфичность масляного трепонемного антигена: с 22 сыворотками получены

отрицательные результаты, с 2-мя - положительные. В КСР все сыворотки дали отрицательный результат, в ЭДС с кардиолипиновым -23 отрицательных ре- 5 зультата и один положительный. Две сыворотки с положительным результатом в реакции преципитации на стекле с масляным трепонемным антигеном, принадлежали людям с хронической гонореей; РИФ с

0 ними - отрицательна. Поэтому, эти два результата можно оценить как неспецифические. Т.к. предлагаемый тест является отборочным, полученные положительные результаты требуют дальнейшего клиниче5 ского обследования и наблюдения за больными для установления окончательного диагноза.

Пример 6. Группа сывороток крови доноров (56) во всех серологических тестах

0 - КСР, ЭДС, с кардиолипином и ДТ с трепонемным масляным антигеном дала отрицательные результаты. Это свидетельствует о выраженной специфической реакции с масляным трепонемным антигеном.

5 Проведенные исследования сывороток крови больных сифилисом и здоровых людей подтвердили большую специфичность и чувствительность диагностического теста с масляным трепонемным антигеном в срав0 нении с кардиолипином в аналогичной реакции преципитации на стекле. Т.о. предлагаемый отборочный тест позволяет при простоте постановки и учета реакции повысить надежность получаемых результа5 тов при массовых обследованиях больших групп людей на сифилис.

Для получения масляного трепонемного культурального озвученного антигена для отборочной реакции на сифилис не требует0 ся отдельного производства, т.к. он готовится на основе коммерческого трепонемного озвученного антигена для РСК.

В данном диагностическом тесте используется специфический антиген, что по5 зволяет повысить надежность получаемых результатов при исследовании сывороток для выявления больных сифилисом людей сравнительно с кардиолипиновым антигеном.

0 Масляныйтрепонемный озвученный антиген, как приготовленный для реакции, так и недоиспользованный, сохраняет свою работоспособность в.течение 1Q дней (срок наблюдения).

7 1797067 .8

Формула изобретенияличающийся тем, что, с целью повыше- Способ экспресс-диагностики сифилй-ния чувствительности способа, в качестве са, включающий забор крови, выделениеспецифического антигена используют антисыворотки, инкубацию ее со специфиче-ген из разрушенных ультразвуком культу- ским антигеном и при появлении микро-ральных трепанем, эмульгированный в преципитата диагностируют сифилис, о т-масле.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в диагностике сифилиса. Цель изобретения - повышение чувствительности способа. В реакции микропреципитации на стекле используют озвученный трепанемный антиген, эмульги- рованный в масле, и при выявлении преципитации диагностируют сифилис. По сравнению с прототипом увеличивается чувствительность способа, достигается экономичность метода.