Способ серодиагностики сифилиса Советский патент 1991 года по МПК A61B10/00 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для повышения точности серодиагностики сифилиса в РИФ- абс.

Целью изобретения является повышение точности способа серодиагностики сифилиса за счет того, что дезинтеграт ультраозвученных бледных трепонем дополнительно центрифугируют, а в качестве сорбента в реакции РИФ-абс используют супернатант.

Способ осуществляется следующим образом.

Культуральные бледные трепонемы I, V, VUI штаммов (по одному представителю от „каждой антигенной группы) выращивают в анаэробных условиях на печеночном бульоне с добавлением кусков печени КРС. рН 8,2 в течение 8 дней. Выросшую культуру фильтруют, центрифугируют при 5,5 X 10 g в течение 30 мин. Осадок дважды отмывают изотоническим раствором хлорида натрия.

Из полученного осадка готовят взвесь трепонем 10 микр. кл/мл по стандарту мутности, далее смесь дезинтегрируют в течение 20 мин и центрифугируют при 103д в течение 30 мин. Полученный осадок (клеточные стенки и наружные фибриллы культуральных бледных трепонем) используют для промышленного получения трепонемного антигена, а супернатант (отходы производства), содержащий белки цитоплазматического цилиндра (цитоплазматические мембраны, мезосомы, внутренние фибриллы, цитоплазма клеток), используют в качестве сорбента при серодиагностике сифилиса в РИФ-абс. Полученный сорбент (супернатант) титруют, для этого его разводят 0,85 %- ным NaO рН 7.2 в 2. 3. 4, 5 раз и ставят РИФ-абс с восьмью сыворотками: одна (1) реэкоположительная (). две (2. 3) слабоположительные (2+). пять (4-8) от людей, свободных от сифилитической инфекции, три из которых дают неспецифическиположительные результаты в РИФ (2+). Все сыворотки разводят предлагаемым сорбентом в соотношении 1:5 и исследуют в РИФ, За титр сорбента принимают такое его разведение, при котором сорбированные сыворотки больных сохраняют степень позитивности, а сыворотки лиц, свободных от сифилиса, не дают свечения.

Оттитрованный сорбент стандартизуют по сериям (установленный титр, т.е. его рабочее разведение вносят в паспорт), разливают по 5 мл во флаконы, лиофилизируют по известному режиму сушки и укупоривают для последующего использования в РИФ- абс серологическими лабораториями.

Для постановки РИФ-абс предварительно готовят следующие ингредиенты: исследуемую сыворотку крови инактивируют при 56°С в течение 30 мин; трепонемный антиген (взвесь патогенных бледных трепо- нем штамма Никольса, полученная из 7-су- точного орхита кролика) должен содержать 40-60 трепонем в поле зрения при микроскопии с темнопольным конденсором; сорбент (предлагаемый) разводят изотоническим раствором хлорида натрия до указанного титра по паспорту; титруют сухую люминесцирующую сыворотку крови против глобулинов человека в РИФ-абс с сыворотками крови людей, разведенных предлагаемым сорбентом в соотношении 1:5 (5 сывороток крови больных сифилисом и 5 сывороток крови лиц, свободных от сифилитической инфекции), и устанавливают рабочий титр по наличию наиболее яркого свечения с положительными сыворотками крови и полное отсутствие свечения клеток трепонем с отрицательными сыворотками крови. Далее полученный титр люминесци- рующей сыворотки проверяют на 100 сыворотках крови людей, причем из них 20% сывороток крови от лиц больных сифилисом.

Берут тонкие обезжиренные предметные стекла, на обратной стороне которых определяют границы нанесения ингредиентов реакции (диаметр 0.7). Затем в пределах круга на стекло наносят трепонемный антиген, высушивают на воздухе и фиксируют 10 мин в химически чистом ацетоне. Далее инактивированную испытуемую сыворотку крови разводят сорбентом, предварительно разведенным по титру в соотношении 1:5, наносят ее на мазок антигена, помещают во влажную камеру, которую затем ставят в термостат при 37°С на 30 мин (I фаза реакции). По истечении времени камеру извлекают из термостата, предметные стекла с первой фазой реакции двукратно промывают фосфатным буфером, причем при втором

промывании для более полного удаления белков, не участвующих в реакции, предметные стекла выдерживают в фосфатном буфере в течение 10 мин, далее высушивают и наносят

на мазок люминесцирующую сыворотку, помещают во влажную камеру и выдерживают при комнатной температуре в течение 30 мин (II фаза реакции). По истечении вр.емени исследуемый образец промывают фосфатным

0 буфером в такой же последовательности, как и после первой фазы реакции, после чего высушивают, наносят на поверхность мазков нелюминесцирующее иммерсионное масло (диметилфталат) и приступают к учету РИФ5 абс в люминесцентном микроскопе с ртутно- кварцевой лампой (ДРШ-250). Учет реакции осуществляют по степени свечения бледных трепонем.

Пример1.У больного В. клинические

0 проявления первичного сифилиса, однако серодиагностика в стационарном комплексе РСК на сифилис отрицательная При постановке РИФ-абс с ультраозвученным антигеном получен слабоположительный

5 результат (2+). Постановка РИФ-абс с сорбентом, приготовленным описанным способом, дала резкоположительный результат (4+). Данный способ позволяет установить диагноз: сифилис первичный в РИФ-абс.

0 Положительный эффект достигается тем. что повышается чувствительность РИФ-абс в два раза, что является исключительно ценным для выполнения оптимальных терапевтических мероприятий в сжатые сроки у

5 данной категории больных.

Пример 2. У больного С. клинические и серологические исследования в РСК на сифилис установили диагноз: сифилис первичный серолоэитивный Сыворотка крови

0 больного С. в РИФ-абс с ультраозвученным трепонемным антигеном дала положительный результат (3+), с сорбентом, приготовленным описанным способом, в РИФ-абс реакция была резкоположительной (4+). Дэн5 ный способ, таким образом, повышает степень позитивности (на 1-i), переводя положительные реакции в резкоположительные.

П р и м е р 3. Больная Г. при заболевании острой вирусной инфекцией дала положи0 тельные реакции в РСК на сифилис. Клинических проявлений позднего сифилиса не выявлено, однако исследования спиномоз- говой жидкости (ликвора), полученного при пункции, дало слабоположительный резуль5 тат в РСК. В РИФ-абс сыворотка крови больной и ликвора дали с улыраозвученным трепонемным антигеном положительные результаты (), с сорбентом, полученным по изобретению, в РИФ-абс реакции были резкоположительными (4+).

Предлагаемый способ позволяет установить диагноз: поздний сифилис, в этом примере повышает степень позитивности (на 1+), переводя положительные реакции в резкоположительные.

Таким образом, сорбент, приготовленный предлагаемым способом, обладает по- вышенной сорбционной емкостью к неспецифическим антителам сыворотки крови, что повышает чувствительность РИФ-абс, а соответственно и серодиагно0

стику сифилиса на 6,8%, а специфичность реакции на 22,2%.

Формула изобретения Способ серодиагностики сифилиса путем постановки реакции РИФ-эбс с использованием дезинтеграта ультраозвученных культур бледных трепонем в качестве сорбента, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, дезинтеграт дополнительно центрифугируют, а в качестве сорбента используют супернатант.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для повышения чувствительности серодиагностики сифилиса в РИФ-абс. Целью изобретения является повышение точности способа за счет того, что дезинтеграт ультраозвученных культур бледных трепонем дополнительно центрифугируют, а в качестве сорбента в РИФ-абс используют супернатант. Сорбент, приготовленный предлагаемым способом, обладает повышенной сорбционной емкостью к неспецифическим антителам сыворотки крови, что повышает чувствительность РИФ-абс, а соответственно и серодиагностику сифилиса на 6.8%. а специфичность реакции на 22 2%.