Способ получения иммуногемосорбента Советский патент 1993 года по МПК A61K45/05 

Изобретение относится к медицине, в частности, к способу получения иммуноге- мосорбента.

Целью изобретения является повышение удельной сорбционной емкости и спектра наносимых на матрицу иммуноглобулинов, которы после иммобилизации могли бы служить лигандом иммуногемосор- бента.

Пример. Готовят рабочий раствор сыворотки кровичеловека из расчета 1 часть сыворотки и 3 части физиологического раствора. Полученный раствор.взятый в объеме 100 см , подвергают униполярной катодной обработке в проточном режиме в описанном выше устройстве при силе тока 50 мА,

перфузируя этот раствор через 200 см ге- мосорбента.СКН-4М с помощью роликового насоса. Время рециркуляции раствора 30 мин. Объемное соотношение пропускаемого раствора и матрицы равно 1:3.

Обработанную таким образом матрицу освобождают от раствора, сушат, отмывают и используют для проведения исследований.

Результаты проведенных испытаний в сравнении с прототипом и контролями приведены в табл. 1 и 2.

Использование заявляемого способа позволяет, по сравнению с прототипом, наносить на матрицу почти все классы иммуноглобулинов, что расширяет ассортимент

х|

О х|

наносимых антител. Причем, удельная сор- бционная емкость гемосорбента (матрицы) относительно иммуноглобулинов при катодной обработке увеличивается более чем в 2 раза. Кроме того, отпадает необходимость перед получением иммуногемосорбента выделять из сыворотки иммуноглобулины для дальнейшего использования их в качестве и.ммунолиганда.

Кроме того, отпадает необходимость перед получением иммуногемосорбента выделять из сыворотки иммуноглобулины для дальнейшего использования их в качестве иммунолигэндэ. .

П р и м е р 2. Выполнение лабораторного опыта иммуногемосорбции с использованием полученного иммуногемосорбента.

Матрицу (готовый углеродный гемосор- бент марки ФАС обрабатывают сывороткой крови человека согласно примера 1. После этого гемосорбент с нанесенными на него иммуноглобулинами отмывают от неадсорбированных белков с помощью физиологического раствора. Далее полученный сорбент подвергают термической обработке при температуре выше 100°С до полного высушивания. При такой термической обработке происходит фиксирование и денатурация нанесенных на матрицу белковых веществ (иммуноглобулинов). Полученный гемосорбент еще раз отмывают физиологическим раствором и используют для проведения испытаний.

Гемосорбент после сливания физиологического раствора смешивают с равным обьемом содержащей антитела к определенному иммуноглобулину сывороткой, {моноспецифической сывороткой), разведенной предварительно в 5 раз. Для контроля аналогичный объем гемосорбента (ФАС), не подвергнутого модификации предлагаемым способом, смешивают в тех же соотношениях с моноспецифическими сыворотками. Испытывают адсорбционную способность опытного и контрольного образца сорбентов к имеющимся в наличии моноспецифическим сывороткам (анти- IgG, анти-igA, анти-lgM). С каждой антисывороткой для количественного выражения результатов адсорбции, ставят титрованную реакцию Манчини. причем, титруют не плазму человека, как общепринято, а саму антисыворотку. Делают разведения антисыворотки 1:5, 1:10, 1:20, 1:40. Каждое разведение пополам смешивают с расплавленным агаром и наносят по 3 мл на предметные стекла. На каждом стекле с агаром делают ряд лунок общепринятым методом. В каждую лунку вносят по 3 микролитра цельной сыворотки человека. Учет

результатов производят на следующий день, через 18 часов. В результате получают ряд предметных стекол, для каждой антисыворотки, для каждого ее разведения свое

стекло и каждому разведению антисыворотки соответствовал свой диаметр кольца преципитации. На основании соответствия разведения антисыворотки и квадрата диаметра преципитационного кольца вычер0 чивают калибровочную кривую. Имея такую кривую.легко установить, насколько уменьшается концентрация антител к конкретному иммуноглобулину после взаимодействия антисыворотки с контрольным

5 гемосорбентом или иммуногемосорбентом. Исследование истощенных сорбентами моноспецифических сывороток производили после перемешивания их в аппарате для встряхивания в течение 30 мин. Результаты

0 проведенных исследований представлены в табл. 3.

Результаты исследований, представленные в таблице, показывают, что после закрепления на матрице денатурированного

5 иммуноглобулиносодержащего лигандз к присущей матрице способности изымать из сыворотки антитела к иммуноглобулину G присоединяется свойство адсорбировать ан -. титела к IgA. а также наиболее активно связы0 вать и антитела к иммуноглобулину М, причем эта способность выражена вдвое сильнее чем к иммуноглобулину G.

Пример 3. Выполнение иммуногемосорбции на кроликах с использованием пол5 ученного иммуногемосорбента.

Готовят иммуногемосорбент согласно примера 1 и 2. Затем расфасовывают во флаконы, заливая небольшим количеством физиологического раствора, рН 7,0 и под0 вергают автоклавированию при 1,2 атм в течение 1 часа. Для проведения контрольных опытов в качестве лиганда используют альбумин человека (10% раствор), Особенность нанесения альбуминового лиганда на

5 матрицу заключалась в том, чт.о полярность электрического тока, используемого для обработки раствора альбумина.меняли на противоположную. Остальные операции проведены согласно примера 1 и 2.

0 Гемосорбент (опытный и контрольный образцы) после сливания физиологического раствора промывают физиологическим раствором, содержащим гепарин (5 тыс. ед. на 100 мл раствора). Далее в шприц

5 емкостью 10 см набирают 3 см3 гемосорбента, пунктируют краевую вену кролика и заполняют шприц до 10 мл кровью. После 10-минутного взаимодействия гемосорбента с кровью осуществляют возврат крови в вену животного.

Никаких патологических реакций после возврата крови не отмечается. Через 2 часа проверяют устойчивость животных {опытных и контрольных) к смертельной дозе 0,1 % раствора гистамина гидрохлорида. Аб- солютная смертельная доза этого медиатора для кроликов устанавливается в предварительных опытах,. Она равнялась в наших опытах для кроликов весом 3 кг 2,1 мл внутривенно введенного раствора или 0,7 мл на 1 кг веса.

Результаты испытаний гемосорбентов представлены в табл. 4.

Результаты исследований, представленные в таблице, показывают, что предла- гаемый иммуногемосорбент по сравнению с контрольным гемосорбентом с неимму- ноглобулиновым белковым лигандом повышает устойчивость кроликов к смертельной дозе аллергического медиатора гистамина, что подтверждается трехкратным увеличением выживаемости животных, подвергнутых маятниковой иммуногемосорбции, от токсического медиатора гистамина.

Использование заявляемого способа позволяет наносить иммуноглобулины на матрицу в достаточно большом количестве, минуя предварительную стадию выделения иммуноглобулинов из сыворотки, значительно увеличивает спектр наносимых на матрицу иммуноглобулинов, a npi: иммобилизации нанесенных иммуноглобулинов с помощью повышенной температуры (100- 120°С)придает способность адсорбировать антитела к иммуногло булинам.

Учитывая широкую доступность метода стерилизации (автоклавированием) и проти- воаллергическое действие за счет трехкратного повышения устойчивости животных к гистамину позволяет использовать полученный иммуногемосорбент для проведения клинических испытаний.

Кроме того, заявляемый способ является экологически чистым, так как позволяет наносить иммунолиганд на матрицу без применения каких-либо химических реагентов, а при использовании термического способа иммобилизации исключает применение и токсических реагентов, например, глутарового альдегида.

Формула, изобретения Способ получения иммуногемосорбен- та, включающий инкубацию гемосорбента с последующей его отмывкой, отличающийся тем, что, с целью повышения удельной сорбционной емкости и спектра иммуноглобулинов, сыворотку перед инкубацией дополнительно обрабатывают в катодной камере при силе тока 50-60 мА в течение 30-40 мин. а инкубацию проводят в проточном режиме.

Изобретение относится к медицине, в частности к способу получения иммуногемо- сорбента. Целью изобретения является повышение удельной сорбционной емкости и спектра иммуноглобулинов. Иммунотемосорбент получают путем нанесения иммуноглобулинов на матрицу, для чего через нее перфузируют водный раствор иммуног- лобулинсодержащей сыворотки, подвергнутый обработке в катодной камере при силе тока 50-60 мА в течение 30-40 мин. Использование изобретения позволяет повысить удельную сорбционную емкость и спектр наносимых на матрицу иммуноглобулинов более чем в два раза, причем позволяет наносить иммуноглобулины сыворотки, минуя стадию их выделения, а после иммобилизации термическим способом придает иммуногемосорбенту способность адсорбировать антитела к иммуноглобулинам. Использование заявляемого способа в эксперименте на животных путем проведения маятниковой иммуногемосорбции позволяет повысить устойчивость животных к аллергическому медиатору гистамину в три раза. 1 ил, 4 табл. со с

Условия получения иммуносорбентов

Иммуносорбент получен без электрообработки раствора сыворотки.

Таблица 1

Свойства полученных иммуносорбентов

ТаблицаЗ

Испытание адсорбционной способности иммуногемосорбента и матрицы относительно ан- тииммуноглобулиновых антител моноспецифических сывороток

Таблица 4

Выживаемость кроликов после проведения маятниковой гемосорбции на опытном и

контрольном гемосорбентах

Таблица 2

Е емкость вспомогаэлектролит

На перфуэию

лига-яда

/