СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУННОЙ ПОЛИВАЛЕНТНОЙ СЫВОРОТКИ ПРОТИВ ГИСТАМИНА И СЕРОТОНИНА Российский патент 1999 года по МПК A61K39/00 

Изобретение относится к области ветеринарии, точнее к ветеринарной иммунологии, к способам получения специфических сывороток против высокоактивных биологических веществ.

Известен способ получения моноспецифических сывороток к иммуноглибулинам животных, в соответствии с которым для иммунизации используют кроликов и баранов.

Согласно этому способу для иммунизации используют кроликов породы Шиншилла с живой массой 2,5 - 3 кг, антигены вводят непосредственно в подкожные лимфоузлы подколенной складки без предварительного обнажения. С этой целью за 7 суток до введения антигена в подушечки задних лапок вводят кроликам по 0,25 - 0,3 мл полного адъюванта Фрейнда, что способствует увеличению подколенных лимфоузлов в размере. Препараты иммуноглобулинов в дозе 5 мг смешивают с равным объемом полного адъюванта Фрейнда и вводят по 0,25 мл в каждый подколенный лимфоузел. Через 15 - 20 суток проводят пробное кровопускание и определяют титр антител. При неудовлетворительном титре через 30 суток после первой инъекции антиген в дозе 0,5 - 1,0 мг/мл вводят внутривенно, а через сутки инъекцию повторяют. Через 10 суток после последней инъекции проводят тотальное обескровливание кроликов. Полученные антисыворотки имеют титр в реакции диффузной преципитации 1:16 - 1:32.

Иммунизацию барана с целью получения антисыворотки к иммуноглобулинам свиньи проводят путем трех подкожных инъекций антигена /2,4 и 6 мг белка/ с 15-суточным интервалом. Антиген вводят в полном адъюванте Фрейнда /1:1/. По окончании цикла иммунизации /через 15 суток после последней инъекции/ проводят пробное кровопускание с определением титра преципитирующих антител в реакции диффузной преципитации. При титре 1:32 получают от барана 300 мл крови с дальнейшим использованием его в качестве донора для получения соответствующей антисыворотки [1].

Однако данный способ, близкий по технической сущности, обладает следующими недостатками: антисыворотка не содержит антител против гистамина и серотонина, имеет низкий титр антител - 1:32 по реакции диффузной преципитации, гибель иммунизированного животного /кролика/, малое количество сыворотки, получаемой за один раз /баран/.

В известном способе, наиболее близком по технической сущности и выбранном за прототип, для иммунизации используют лошадей.

Согласно этому способу антикератотоксическую сыворотку изготавливают из сыворотки крови лошадей, иммунизированных антигеном, и предназначают в качестве средства, повышающего резистентность при гнойно-некротических поражениях копытец у крупного рогатого скота.

Антиген представляет собой гомогенную суспензию, изготовленную из тканей кожи межпальцевой щели, тканей венчика и основы кожи копытец, взятых при убое крупного рогатого скота. Ткань должна быть суспензирована в вазелиновом масле ГОСТ 3164-78 и ланолине ГФХ в соотношении 1:1:3.

Иммунизация лошадей должна проводиться антигеном на здоровых животных, поступающих из местности, благополучной по инфекционным и инвазионным заболеваниям.

Антиген вводят подкожно, в области верхней трети шеи лошади трехкратно в дозе 5, 10, и 15 см³ с интервалом 10 дней после каждой инъекции.

Кровь для получения сыворотки у животных берут через 10 дней после последнего введения антигена по общепринятой методике с соблюдением правил асептики и антисептики.

Данный способ, близкий по технической сущности, обладает следующими недостатками: не содержит антител против гистамина и серотонина, получаемая сыворотка имеет низкий титр антител - 1:600 по иммуногистохимическому методу, высокая трудоемкость приготовления антигена.

Целью изобретения является получение иммунной поливалентной сыворотки, содержащей антитела против гистамина и серотонина и упрощение способа с одновременным сокращением сроков иммунизации.

Поставленная цель достигается тем, что в способе получения иммунной сыворотки против гистамина и серотонина путем подкожной иммунизации животного конъюгатом гистамина и серотонина в несколько циклов с последующим выделением сыворотки из забранной крови и определения в ней специфической активности, согласно изобретению проводят иммунизацию лошади, при этом в качестве конъюгата гистамина и серотонина используют гистосероглобин, который вводят в места расположения поверхностных шейных лимфатических узлов и лимфоузлов коленной складки с обеих сторон в 2 цикла /с интервалом в 14 дней между циклами/, а забор крови осуществляют не менее 2-х раз в количестве 8 - 9 л.

Сопоставительный анализ заявляемого решения со способом, выбранным за прототип, показал, что новое решение обладает следующими отличительными признаками: получение поливалентной сыворотки, использование в качестве антигена гистосероглобина, упрощение и сокращение сроков иммунизации.

Наличие отличительных признаков обеспечивает соответствие заявляемого решения критерию "новизна".

Анализ доступных авторам источников информации показал, что известно использование лошади в качестве объекта иммунизации для получения иммунных сывороток [3], однако для получения иммунной сыворотки против гистамина и серотонина лошадь ранее не использовалась.

Гистосероглобин - известный препарат, применяемый в предлагаемом способе по прямому назначению /вернее с использованием его свойства - иммуногенности/.

Как оказалось, проведение иммунизации лошади гистосероглобином в места расположения крупных лимфатических узлов - поверхностных шейных и коленной складки /в прототипе - иммунизация гомогенной суспензией, приготовленной из тканей кожи межпальцевой щели, тканей венчика и основы кожи копытец/ - по предложенной схеме позволило получить сыворотку с высоким титром содержания антител против гистамина и серотонина, при использовании гистосероглобина в качестве антигена для иммунизации. Гистосероглобин - препарат с повышенными иммуногенными свойствами, получаемый в производственных условиях и являющийся комплексным препаратом, в состав которого входят изотонический раствор натрия хлорида, иммуноглобулин, гистамин и серотонин.

Забор большого количества крови не менее двух раз после реиммунизации в сочетании с другими признаками, характеризующими заявленный способ, приводит к резкому увеличению титра антител к гистамину и серотонину.

Использование лошади в качестве объекта иммунизации в заявленном способе позволяет получить выход большого количества конечного продукта: 3,0 - 3,5 л, а также животное может быть использовано многократно, без повторных иммунизаций.

Таким образом, все указанные отличительные признаки являются необходимыми, а вместе - достаточными для достижения поставленной цели - получения сыворотки с высоким титром антител против гистамина и серотонина. То есть эти признаки являются существенными /следует отметить, что признаки тесно связаны между собой и трудно выделить вклад отдельного признака в достижение поставленной цели/.

В совокупности с другими существенными признаками заявляемого технического решения, как показали исследования, проведенные авторами, удается получить сыворотку с высоким титром антител к гистамину и серотонину до 1:4096 /по методу непрямой гемагглютинации/ - то есть получить новый результат. Таким образом, заявляемое решение соответствует критерию "существенные отличия".

Предлагаемый способ получения иммунной сыворотки против гистамина и серотонина осуществляют следующим способом:
- Осуществляют подкожную иммунизацию лошади гистосероглобином в места расположения крупных лимфатических узлов в два цикла:
1 цикл: животному вводят подкожно в области поверхностных шейных лимфатических узлов и узлов коленной складки с двух сторон гистосероглобин с полным адъювантом Фрейнда по 5 мл. Через 7 дней проводят повторную инъекцию гистосероглобином /10 мл/ с полным адъювантом Фрейнда /10 мл/ подкожно в те же точки.

2 цикл: через 14 дней /после 1 цикла/ проводят реиммунизацию гистосероглобином с полным адъювантом по 10 мл и далее через каждые 4 - 5 дней по 20, 40 и 80 мл подкожно в те же точки.

- осуществляют забор крови не менее 2-х раз:
1 забор: проводится через 14 дней после реиммунизации, берется 8 - 9 л крови,
2 забор: проводят через 48 чесов после первого забора и берут 7 - 8 л (на 1 л меньше).

3 забор: третье взятие крови в количестве 8 - 9 л проводят через 30 дней после реиммунизации.

- в конечном целевом продукте определяют титр антител гистамина и серотонина (например, методом непрямой гемагглютинации).

Следующие примеры иллюстрируют осуществление заявляемого способа получения иммунной сыворотки против гистамина и серотонина.

Пример 1. Лошадь 5-летнего возраста, серой масти, средней упитанности, весом 500 кг, практически здорова. Осуществлена иммунизация гистосероглобином в места расположения крупных лимфатических узлов в соответствии со схемой, предлагаемой в заявленном способе. Иммунизацию проводили в два цикла, согласно вышеуказанной схеме. Забор крови осуществляли трижды. В конечном целевом продукте определяли титр антител против гистамина и серотонина методом непрямой гемагглютинации по Бойдену.

Реакция непрямой гемагглютинации по Бойдену основана на способности предварительно обработанных танином эритроцитов адсорбировать на себе белок. Сенсибилизированные гистосероглобином эритроциты дают агглютинациию в присутствии антител к гистосероглобину. Эритроциты барана готовят заранее с помощью консервации формалином.

В день постановки опыта готовят:
- буфер N 1 - pH 7,2 - 70 ч. 0,158 M раствора. +30 ч. 0,158 M раствора. KH₂PO₄.

- буфер N 2 - pH 6,4 - 30 ч. 0,158 M раствора. Na₂HPO₄ + 70 ч. 0,158 M раствора. KH₂PO₄.

Оба буфера разводят физраствором в соотношении 1:1.

Обработка эритроцитов танином: к 10% взвеси эритроцитов добавляют половинное количество буфера N 1 и такой же объем танина /в разведении 1:20000/, инкубируют в течение 30 мин при 20^oC, центрифугируют, отмывают осадок оставшейся половиной буфера N 1 и разводят физраствором.

Сенсибилизация эритроцитов: гистосероглобин разводят растворителем до содержания белка 1 мг/мл, инактивируют при 56^oC в течение 40 мин на водяной бане. К одному объему эритроцитов добавляют 4 объема буфера N 2 и один объем гистосероглобина /в контроле - 1 объем физраствора/, размешивают и ставят в термостат при 37^oС на 30 мин; Цетрифугируют, осадок отмывают дважды двойным объемом инактивированной сыворотки морской свинки в разведении 1:200 и ею разводят полученные сенсибилизированные эритроциты до 2,5% взвеси.

Реакцию ставят на полистироловых пластинках. Из испытуемой сыворотки готовят 4 одинаковых ряда разведенной в объеме 1 мл, начиная с 1:2 и так далее. В каждый вносят соответственно по 0,1 мл контрольных эритроцитов, нагруженных гистосероглобином. Инкубируют в термостате при 37^oС в течение 2 ч, после чего проводят учет реакции.

Наблюдали нарастание титра антител. Результаты представлены в табл. 1.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что уже при втором заборе крови титр антител к гистамину и серотонину в получаемой сыворотке выше, чем соответственно в первом. В дальнейшем наблюдается нарастание титра антител против гистамина и серотонина в получаемой в соответствии с заявляемым способом сыворотке. Титр полученной сыворотке свидетельствует о гипериммунности конечного продукта.

Пример 2. Для иммунизации взяты две лошади - 3 и 5 лет, средней упитанности, практически здоровые. Лошади проиммунизированы в соответствии с предлагаемой схемой /в два цикла в места расположения крупных лимфатических узлов - поверхностных шейных лимфоузлов и лимфоузлов коленной складки с обеих сторон - гистосероглобином/.

Результаты представлены в табл. 2.

Проведенные испытания заявляемого способа /3 лошади/ подтвердили его преимущества перед способом прототипом: Сыворотка, получаемая от животных, - поливалентна, то есть содержит антитела против гистамина и серотонина, использование полного адъюванта Фрейнда, обладающего большей степенью стимуляции иммуногенности лошадей, что позволило получить сыворотку с титром антител против гистамина и серотонина 1:4096 по методу РНПГА при сокращении сроков иммунизации в 1,7 раза.

Полученные преимущества предлагаемого способа позволяют рекомендовать его для широкого применения в ветеринарной практике с целью получения антисыворотки к низкомолекулярным биологическим веществам - гистамину и серотонину.

Литература
1. Ю. Н. Федотов, С.О.Кадыров и др. "Технология получения моноспецифических сывороток к иммуноглобулинам животных", М., 1988, Труды, ВИЭВ, т. 66, с. 41 - 46.

2. Н.П.Щербаков "Лечение и профилактика гнойно-некротических заболеваний пальцев у крупного рогатого скота и копытной гнили овец", Автореферат на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук, Санкт-Петербург, 1994, 25 стр.

3. Руководство по вакционному и сывороточному делу - Под редакцией П.Н. Бургасова.-М.: Медицина, 1978, с. 260 - 264.

4. М.Д.Машковский "Лекарственные средства".-М.: Медицина, 1972, с. 165.

5. Е.Ф.Чернушенко, Л.С.Когосова "Иммунологические исследования в клинике", Киев, Здоровья, 1978, с. 73 - 74.

6. Иммунохимический анализ /Под редакцией Л.А.Зильбера, Москва, Медицина, 1968, с. 11 - 14.

Изобретение относится к ветеринарии, а именно к ветеринарной иммунологии - к способам получения специфических сывороток против высокоактивных биологических веществ. Способ заключается в том, что осуществляют иммунизацию лошади. Для этого вводят гистосероглобин с полным адъювантом Фрейнда в месте расположения поверхностных шейных лимфатических узлов и лимфоузлов коленной складки с обеих сторон в два цикла с интервалом в 14 дней между циклами. Осуществляют многократный (не менее 2-х раз) забор большого количества крови - 8-9 л. В первом цикле его вводят дважды: вначале по 5 мм каждого вещества и через 7 дней по 10 мл. На втором этапе - вначале по 10 мл, а затем трижды через каждые 4-5 дней соответственно по 20, 40 и 80 мл. Способ позволяет получить сыворотку с высоким титром антител и увеличить выход готового продукта. 1 з.п. ф-лы, 2 табл.

1. Способ получения иммунной поливалентной сыворотки против гистамина и серотонина, отличающийся тем, что осуществляют иммунизацию лошади путем подкожного введения в область поверхностных шейных лимфатических узлов и узлов коленной складки с двух сторон гистосероглобина с полным адьювантом Фрейнда в два цикла с интервалом в 14 дней, при этом в первом цикле гистосероглобин с полным адъювантом Фрейнда вводят дважды: вначале по 5 мл каждого вещества и через 7 дней по 10 мл, а во втором цикле - вначале по 10 мл, а затем трижды через каждые 4 - 5 дней соответственно по 20, 40 и 80 мл, после иммунизации осуществляют забор крови не менее двух раз по 7 - 9 л. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что первый забор крови у лошади проводят через 14 дней после осуществления второго цикла иммунизации животного, а второй - через 48 ч после первого забора в количестве 7 - 8 л.