Штамм бактерий BacILLUS acIDocaLDaRIUS, используемый для силосования соломы Советский патент 1993 года по МПК C12N9/42 C12N1/20 A23K3/00 

Изобретение относится к сельскому хозяйству и может быть использовано в кормопроизводстве для микробной конверсии соломы или других целлюлозосодержащих субстрате в с целью получения корма с повышенными по сравнению с исходным сырьем поедаемостью и питательностью.

Целью изобретения является получение нового штамма бактерий, ассимилирующих целлюлозу.

Это достигается применением Bacillus acidocaldarius 17 - штамма, отличающегося от штамма-прототипа C.flavigena более высокой популяционной устойчивостью и технологичностью, что способствует снижению затрат и получению стабильных результатов как при производстве закваски, так и при биоконверсии субстрата, осуществляемой по методу силосования. Преимуществом

предлагаемого штамма перед ранее извест- ным является отсутствие полиморфное™ и популяционная устойчивость. Способность SO 1 B.acidocaldarlus 17 к спорообразованию, его sQ термоустойчивость и ацидотолерантность Јд} обеспечивает более высокую выживаемость s в экстремальных условиях, в частности при «ч приготовлении сухих препаратов методом j распылительной или лиофильной сушки, а также в процессе созревания силоса, когда Јд} температура силосуемой массы возрастет до и выше. Эта температура в сочетании с кислыми значениями рН среды вызывает гибель штамма-прототипа и прекращение процесса расщепления целлюлозы, тогда как В.acidocaldarius 17 в этих условиях остается жизнестойким и активным. В.acidocaldarius 17 отличается от C.flavigena 22 значительно более высокими

.показателями скорости роста, активности накопления биомассы и экономического коэффициента, что снижает затраты на производство бактериальных заквасок.

Высокая технологичность штамма B.acidocaldarius, установленная в лабораторных опытах, в процессе наработки заквасок на опытно-промышленной установке Института микробиологии и вирусологии АН республики Казахстан, а также в производственных испытаниях показала перспективность его широкого, внедрения в кормопроизводстве. Этот штамм рекомендован, для получения заквасок в условиях промышленного производства. На Степно- горской научной опытно-промышленной базе (СНОПБ ПО Прогресс) отработан опытно-промышленный регламент получения его биомассы.

Предлагаемый штамм бактерий B.acidocaldarius 17 имеет следующую морфологическую и физиологическую характеристику.

Грамположительные бактерии относятся к температуре- и кислотоустойчивым. .Представляют собой палочки с закругленными концами, размер 0,8 х 3,5 микрон; с возрастом они по форме приближаются к коккам. Располагаются поодиночке, парами и короткими цепочками. Концевые .споры. Подвижны, факультативный аэроб.

Ферментативные свойства.

а)сахаролитические:

1. Расщепляют глюкозу, арабинозу, ксилозу, сахарозу, мальтозу до кислоты. При сбраживании углеводов газы не образуют,

2. Гидролизуютполисахэриды: крахмал, декстрин и целлюлозу.

3. Из спиртов гидролизуют ма.ннит, дульцит нет.

б) протеолитические:

1. На МПБ аммиак образуют хорошо, а индол и сероводород слабо.

2. Желатину разжижают,. .

3. Вызывают подщелочение и протео-. лиз молока.

1. Ацетоин не образуют.

2. Каталазу образуют.,

3. Тирозин не расщепляют.

4. Казеин не гидролизуют.

5. Нитраты восстанавливаются в нитриты.

6. На 0,001% лизоциме роста нет,

7. На МПБ образуют щелрчь.

8. На 1-10% NaCI рост хороший.

9. На среде Сабуро рост хороший. Коло1 ния серого цвета с легким розовым оттенком.

10. Рост на МПБ - пленка тонкая. Среда прозрачная. Осадок средний, рыхлый.

11. Рост на РПА - поверхность мозго- видная. Матовая (мучнистая). Бежево-серого цвета. Край колонии лопастной. Структура крупнозернистая, консистенция плотная, легко снимается с агара пленкой, не тянется за петлей (не слизистая). Способность эмульгиррваться - взвесь в виде обрывок пленки.

12. Желатина уколом. Светло-бежевый поверхностный рост. Разжижение послойное, очень медленное.

Штамм синтезирует конститутивно комплекс целлюлаз, характерных для целлюло- литических бактерий. При концентрации 10 бактериальных клеток в 1 мл среды цел- люлолитическая активность равна 7-9 мг

рв/мл. (на фильтровальной бумаге);

Культуру хранят на скошенном сусло- агаре или 0,7% соломенном агаре при 5°С. пересев необходим через два месяца. Для культивирования штамма применяют жидкую среду следующего состава, г/л:

NaN03 :2,0 К2НР04 1,0 MgSO/j 0,3. NaCI 1.0 Дрожжевой автрлиззт 1,0 Глюкоза или крахмал : Юг Культивирование 24 ч 30-35°С, рН - 6-7. Штамм выделен из прелой соломы путем пересевов на среду с соломенным агаром. Способен развиваться на соломе в анаэробных условиях при значениях рН силоса 3,8-4,7.

у . .; ... .:; -;: .

. Для углубления процесса бактериальной конверсии целлюлозы B.acidocaldarius 17 (ЦЛБ) используется в смешанной культуре со Streptococcus lactis diastaticus (AMC),

который ассимилирует продукты метаболизма целлюлолитических бактерий, устраняя явление катаболитнрй репрессии и стимулирует его рост какими-то (неиденти- фиц рованными) продуктами своего метаболизма, не оказывая антагонистического воздействия. Наличие у этих микроорганизмов предпосылок к симбиотическому сосуществованию позволяет выращивать их биомассу, используемую для приготовления

заквасок в одной ферментации, что повышает его экономическую эффективность.

П р и м е р 1, Предложенный нами штамм целлюлол.итических бактерий B.acidocaldarius 17 и штамм-прототип

Cellutomonas flavigena 22 выращивали в лабораторном ферментере с рабочим объемом 2 л на видоизмененной среде Гетчинсона (г/л): МаМОз 2.0; K2HPO/I 1.0; MgSO 0.3; NaCI 1,0; дрожжевой эвтолизат 1.0; ГЛЮКОЗА

10 г. Культивирование осуществляли с перемешиванием при 32°С, рН - 6-7.

Удельнаяскорость роста В .acidocaldarius составила 0,42 , C.flavigena - 0,10 . Стационарная фаза роста у первого штамма наблюдается через 17 ч культивирования, максимальный синтез ферментов целлюлозного комплекса - через 24 ч. Количество биомассы составила 4,1 г/л, экономический коэффициент переработки субстрата 0,51, продуктивность 1,72 г/л в час, Время генерации 1 ч 39 мин.

Время культивирования C.flavigena до начала стационарной фазы составляет 6 ч, накопление биомассы 3,6 г/л, экономический коэффициент переработки субстрата 0,40, продуктивность 0,36 г/л в час, время генерации 6 ч 56 мин.

С помощью того и другого штаммов цел- люлолитических бактерий была проведена твердофазная ферментация пшеничной соломы.

Солому измельчаютдо размера 3-10 см, Применяется обычная технология силосования кормов. Осуществляется послойное увлажнение соломы водным раствором до влажности ее 65%. Раствор, равномерно разбрызгивается по всей поверхности силосуемой массы из цистерны с помощью насоса через шланг с распылителем на конце. Рабочий раствор состоит из закваски ЦЛ Б и АМС (1:1) из расчета 3 г сухого препарата титр 10 клеток в мл на 1 т соломы в 1,0% поваренной соли. После тщательной трамбовки трактором, траншея герметически закрывается пленкой. ... . Анализ полученного продукта проводили через 30 дней. Органолептические показатели того и другого силоса хорошие. При использовании В.acidocaldarius 17 силос имеет запах хлебной опары, при силосовании C.flavigena 22 -квашенных овощей, рЙ В том и другом случае 4,3-4,4, сумма органических кислот 1,6 г/кг. Таким образом, мож- но сделать вывод о том, что органолептичёские показатели, определяющие поедаемость силоса при использовании различных целлюлолитичёских бактерий практически не различаются. Определение количества трудногидролизуе- мы.х пол исахаридов (целлюлозы) в полученных образцах силоса показало, что при использовании предложенного штамма .бактерий В.acidocaldarius 17 процесс деструкции их происходит глубже. Так, содержание целлюлозы снизилось на 10%, тогда как в случае C.flavigena на 8,5%.

Поскольку гидролиз трудногидролизуе- мых полисахаридов осуществляется с помощью ЦЛБ, способствуя улучшению

переваримости корма, следует признать преимущество заявляемого штямма над штаммом-прототипом.

Пример 2. Как показали наши ранее приведенные исследования,благоприятное влияние на развитие C.flavigena 22 оказывает штамм молочнокислых бактерий Lpentoaceticum В(б)-23. Рост В.acidocaldarius

17 стимулируется другим штаммом молочнокислых бактерий Str. lactis diastaticus. Проведена твердофазная ферментация пшеничной соломы с использованием отобранных смешанных культур целлюлолитичёских и молоч- нокисДых бактерий.

. Культуры были выращены в лабораторных условиях (см. пример 1) и перед применением целл.юлолитические бактерии смешаны с. молочнокислыми.в соотношении 1:1.

Полученные результаты показали, что при применении смешанных культур целлюлолитичёских и молочнокислых бактерий в том и другом варианте для силосования соломы полученный продукт незначительно

отличается от силоса, приготовленного с заквасками из монокультур целлюлолитичёских бактерий. В нем определяется лишь немного больше молочной кислоты (на 0,1т 0,2% в зависимости от варианта опыта) и

несколько меньшее количество связанной масляной кислоты. По-видимому, при использовании монокультуры целлюлолитичёских бактерий органические кислоты продуцируются представителями спонтанной молочнокислой флоры в изобилии встречающейся в доброкачественной соломе. Для подтверждения этого предположения в следующей серии опытов силосовали пшеничную солому, предварительно подвергнутую щелочной предобработке, которая с одной стороны способствует делигнификации ее, а с другой убивает . спонтанную микрофлору (табл.2). Полученные данные показали, что использование в

этом случае монокультуры целлюлолитичёских бактерий приводит.к получению продуктас отрицательными органолептическимй. показателями (неприятный запах и вкус), который не поедается

животными. Кроме того, в щелочных условиях при этом возможно развитие гнилостной микрофлоры. Показано, что для получения полноценного продукта из предобработан- ной щелочью соломы необходимо введение

в состав закваски молочнокислых бактерий. В результате их развития накапливаются молочная и уксусная кислоты, снижающие рН среды и обеспечивающие консервируе- мость продукта, а также улучшающие органолептичёские показатели.

Приведенные результаты позволяют сделать заключение о том, что для обеспечения нужной направленности процесса в случае использования для бйоконверсии нестандартного сырья необходимо введение в 5 состав закваски помимо целлюлолитиче- ских также и молочнокислых бактерий.

Приведенные ниже данные позволяют сделать заключение о преимуществе смешанной культуры ЦЛБ и АМС.10

Пример 3. Биомасса C.flavlgena (прототип), выращенная на опытно-промышленной установке института, титр ее 0,2 млрд.кл/ г. Микроскопирование и высевы 15 культуры на питательные среды показало высокую полиморфность ее. Клетки представляют собой смесь кокков и палочек грампо.ложительных и грамотрицательных. Целлюлолитическую активность получен- 20 ной биомассы трудно контролировать, т.к. для проявления ее в составе среды необходимо иметь индуктор (источник целлюлозы), который вызывает более низкую скорость роста культуры, но обеспечивает синтез 25 комплекса целлюлаз. По этой причине биомасса С.flavigena, полученная на средах, содержащих в качестве источника углерода легкоусвояемые сахара зачастую имеют очень низкую целлюлолитическую актив- 30 ность или не имеют вообще.

При культивировании B.acidocaldarius на среде, описанной выше, максимальная целлюлолмтическая активность отмечается

через 24 ч культивирования. температуре 50°С активность зы (КМЦазы) достигается 140 тивность на фильтровальной б 9 мг РВ/мл, целлобиэзы - 3 м

Полученные в промышле . терах (СНОПБ ПО Прогресс) тии, закваски (сухая и па B.acidocaldarius (Кальдарин) и щую характеристику

Культура однородная, чис лена наличием, грамположит чек, в начале стационарной наблюдается появление един

Целлюлолитическая актив жена как при наличии в среде держащих источников угл ;, у моносахаров. Конститутивны та у B.acidocaldarjus позволяе прототипа получить активную любом утилизируемом субстр

Таким образом, предлож целлюлолитических B.acidocaldarius 17 отличаетс го более высокой технологичн .зволяет успешно использо стабильного производства за печивающих высокое качеств кормового продукта.

Формула изобрет

Штамм бактерий Bacillus ВКПМ В-5250, используемый ния соломы.

Т а б л и ц а 1 Сравнительная характеристика производственно-ценных свойств предлагаемого штамма бактерий и штамма прототипа

через 24 ч культивирования. При рМ 6.0 и температуре 50°С активность эндоклюкаия- зы (КМЦазы) достигается 140 мг РВ/мл. активность на фильтровальной бумаге (АФБ) - 9 мг РВ/мл, целлобиэзы - 3 мг глюк/мл.

Полученные в промышленных фермен- . терах (СНОПБ ПО Прогресс) опытные партии, закваски (сухая и пастообразная) B.acidocaldarius (Кальдарин) имеет следующую характеристику

Культура однородная, чистая, представлена наличием, грамположительных палочек, в начале стационарной фазы роста наблюдается появление единичных спор.

Целлюлолитическая активность обнаружена как при наличии в среде целлюлозосо- держащих источников углерода, так и ;, у моносахаров. Конститутивный тип фермента у B.acidocaldarjus позволяет в отличие от прототипа получить активную биомассу на любом утилизируемом субстрате.

Таким образом, предложенный штамм целлюлолитическихбактерий B.acidocaldarius 17 отличается от известного более высокой технологичностью, что по- .зволяет успешно использовать его для стабильного производства заквасок, обеспечивающих высокое качество получаемого кормового продукта. .

Формула изобретения

Штамм бактерий Bacillus acidocaldarius ВКПМ В-5250, используемый для силосования соломы.

Использование: биотехнология и может быть использовано при производстве биомассы бактерий, используемой в качестве закваски для биоконверсии (силосования) соломы. Сущность изобретения: полученный штамм бактерий Bacillus acidocaldarius

На-карбоксияметил- целлолоза

Способность сбоажвэть.-. пеитозы (ксилозу и араби нозу)

Активность ферментов целлюлозного комплекс : эндоглпханаза (КМЦаза)

на фильтровальной бумаге

целгооиаэа

Потребность в Факторах рсста

0,32 Сбракивают

мг Рв/мл - 13,1 ея/кл

3 мг РВ/мл - 0,83 ед/мп 1 мг глиж./мл-0,28ед/мл Не нуждается

Показатели биохимического анализа силоса из нативной пшеничной соломы и из предобработанной 0, 5% раствором шелочи

Характеристика опытных партий закваски

Таблицэ2

ТаблицаЗ