Способ моделирования аллергических состояний у экспериментальных животных Советский патент 1993 года по МПК G09B23/28 

Изобретение относится к экспериментальной аллергологии, в частности к способу моделирования у экспериментальных животных аллергических состояний, которые характеризуются повышенным уровнем сывороточного иммуноглобулина класса

фдЕ).

; Цель изобретения - упрощение и повы- и|ение эффективности моделирования аллергических состояний у экспериментальных Животных.

i Поставленная цель достигается предла- способом, который заключается в т)м, что экспериментальным животным вво- дрт модельный аллерген и кватернизованные сополимеры N-цетил и М-этилполи-4-винил- пйридиний-бромидов (СП) общей формулы:

г«е {сн-садсн-адсн-сюр1PBF

.в

К@ВГЭ

С2Н5 С1бйзз

где-{-СН-СН)т -6-10% (СН-СН)П -80-85%

К®Бге U -{CH-CHh -5-1

u®Bre

MM. 200000-220000; 1бН

в дозе 5-50 мг/кг массы животного.

Отличием способа является использование в качестве адъюванта кватерни- зованных сополимеров N-цетил и М-этиполи-4-винилпиридиний бромидов вышеуказанной общей формулы в дозе 5-50 мг/кг массы животного. Используемые сополимеры не требуют предварительного смешивания с антигеном и действуют при одновременном с ним введении. СП различного состава и с разной степенью полимеризации получены ранее и охарактеризованы физико-химическими методами исследова00

о

1GJ Ю Ю 00

ний. Известно, что они проявляют в отношении иммунокомпетентных клеток митоген- ные свойства. Использование их в качестве адьювантов для индукции IgE ответа неизвестно.

Для достижения цели предполагаемого изобретения необходимо вводить животным СП в дозах 5-50 мг/кг. Введение СП в дозе менее 5 мг/кг усиления продукции IgE специфических антител не вызывает. Применение доз более 50 мг/кг не целесообразно, так как дальнейшего усиления синтеза IgE антител не происходит.

Основой для получения СП служит поли-4- винилпиридин с молекулярной массой 97 кД. После кватернизации поли-4-винилпириди- на цетилбромидом полученный продукт до- алкилировали бромистым этилом. Сополимеры представляют собой лиофиль- но высушенные порошки, хорошо растворимые в воде. Препараты легко дозируются путем приготовления водных растворов определенных концентраций. После полного растворения препаратов СП (4-6 ч при комнатной температуре или 15 мин при 37°С) рН их водных растворов доводят до 7,0 1Н NaOH. Перед иммунизацией растворы СП стерилизуют фильтрацией через мембранные фильтры с размером пор 0,22 мкн. В лиофильно высушенном состоянии препараты СП хорошо хранятся и (по нашим данным) по крайней мере в течение 3 лет не теряют своей адъювантной активности. Все эти качества делают их гораздо более удобным в экспериментальном использовании по сравнению с ПАФ, МГ, личинками гельминтов или солями ртути. Выбор в качестве модельного аллергена овальбумина (ОА) обусловлен его способностью при введении экспериментальным животным индуцировать специфический IgE ответ и широким использованием в экспериментальной лабораторной практике. Используемая для введения доза модельного аллергена ОА традиционна для подобного моделирования IgE ответа у экспериментальных животных.

Проверка заявленного технического решения на соответствие его критерию суще- ственные отличия показала, что ни в патентной ни в научной литературе не выявлено совокупности признаков, указанной в формуле изобретения.

Примеры осуществления способа.

Пример 1. Испытана способность СП индуцировать специфический IgE ответ в эксперименте на мышах (СВА х С57В1 /6)Fi массой 18-20 г. В каждую экспериментальную группу брали по 8-10 мышей. СП, содержащий 5 моль% звеньев цетилбромида

на/1000 мономерных звень-ев винилпириди- на (СП5) с молекул.массой 205 кД вводили мышам внутрибрюшинно в дозах 0,25; 0,5; 2,5; 5; 25 и 50 мг/кг массы тела. ОА также

инъецировали внутрибрюшинно в дозе 0,5 мг/кг. Мышам контрольных групп инъецировали один ОА, ОА, эмульгированный в 0,2 мл ПАФ, или ОА, адсорбированный на 2,5 мг МГ, который получали по ранее описанной

0 методике 3. На 21 день после иммунизации мышей всех групп вторично иммунировали одним ОА в дозе 0,5 мг/кг. Влияние введения различных адъювантов на развитие специфического IgE ответа оценивали по

5 уровню анти-ОА гомоцитотропных антител в сыворотке иммунизированных мышей. Кровь на определенные сроки после иммунизации получали от каждой мыши индивидуально из ретробульбарного венозного

0 сплетения. Сыворотку от сгустка форменных отделяли центрифугированием. Смешивая одинаковые объемы индивидуально полученных сывороток внутри каждой экспериментальной группы, получали пул сы5 вороток, который затем тестировали в реакции пассивной кожной анафилаксии. Титры IgE и IgGI гомоцитотропных антител в пуле сывороток мышей одной группы определяли по стандартной методике 7, 15,

0 16 на 5 беспородных крысах-самцах массой 200-260 г или 5 беспородных мышах-самках массой 18-22 г соответственно. Животным под эфирным наркозом строго внутрикожно (крысам на животе, мышам на спине) вводи5 ли микрошприцем по 30 мкл последователь- ных двукратных разведении пулов сывороток, приготовленных на 0,9% растворе NaCI. Разрешающую дозу ОА вводили под эфирным наркозом в хвостовую вену

0 крысам через 24-48 ч (100 мкг/100 г массы в 1 мл 0,5% раствора синего Эванса), мышам через 2 ч (500 мкг в 0,2 мл 0,5% раствора синего Эванса). Через 30 мин животных под эфирным наркозом декапитировали и учи5 тывали результаты реакции пассивной кожной анафилаксии на внутренней стороне кожи живота или спины соответственно. За титр гомоцитотропных анти-ОА антител в тестируемом пуле сывороток принимали по0 следнёе из его разведении, дающее прокра- шивание участков кожи в местах внутрикожных инъекций размером не менее 5 мм в диаметре. Результаты выражали в логарифмах по основанию 2 величин, об5 ратных титрам гомоцитотропных антител в реакции пассивной кожной анафилаксии, и брали среднее арифметическое значение, полученных на 5 животных. При статическом анализе достоверности различий в титрах гомоцитотропных антител между

Таблица 1

Использование: экспериментальная зллер- гология, в частности способы моделирования аллергических состояний у экспериментальных животных. Сущность изобретения: экспериментальным животным вводят модельный аллерген в присутствии адьюванта, в качестве которого используют кватернизированные сополимеры П-цетил и П-этилполи-4-винилпири- диний бромидов М.М.200000-220000 в дозе от 5 до 50 мг/кг массы животного. Способ прост в исполнении, позволяет эффективно моделировать аллергические состояния у экспериментальных животных.

Титры анти-ОА IgE гомоцитотропных антител в сыворотке

крови мышей после первичной иммунизации ОА с разными

адъювантами и вторичной иммунизации на 21-й день одним О А

Примечание. Значком обозначены титры гомоцитотропных IgE антител к ОА. достоверно превышающие аналогичный показатель в контрольной группе мышей.

Титры анти-ОА IgE гомоцитотропных антител в сыворотке

крови мышей после первичной иммунизации ОА с СП разного

состава и вторичной иммунизации на 21-й день одним ОА

Примечание. Значком обозначены титры гомоцитотропных IgE антител к ОА, достоверно превышающие аналогичный показатель в контрольной группе мышей.

Таблица 2

Титры анти-ОА IgE гомоцитотропных антител в сыворотке

крови мышей иммунизированных первично ОА и после различных

способов введения СП и вторично на 21-й день одним ОА

Первичная иммунизация

7-й день после первичной им- мунизации

ОА (без адъювантов) ОА в/б; ПАФ п/к ОА в/б; МГ п/к ОА в/б; СП п/к ОА в/б; СП в/б

Примечание. Значком обозначены титры гомоцитотропных IgE антител к ОА, достоверно превышающие аналогичный показатель в контрольной группе мышей.

Таблица 3

7-й день после вторичной им- мунизации

2,33 2,50 2,50 4,50 5,33