Способ прогнозирования течения офтальмогерпеса у мужчин Советский патент 1993 года по МПК G01N33/74 

Изобретение относится к области медицины, о частности к офтальмологии.

Цель изобретения - увеличение числа одновременно проводимых прогнозов оф- тальмогерпеса у больных.

Способ осуществляют следующим образом,

Из вены больного (до 43 при наличии одного набора для радиоиммунологическо- го определения) берется кровь в количестве 5-7 мл, после ретракции сгустка сыворотка отбирается в три пробирки: в две по 0,1 мл для определения тестостерона и о одну - 1 мл для выявления простогландина Е.

При определении тестостерона с целью его экстракции в каждую из двух пробирок, содержащих по 0,1 мл, добавляют по 3 мл диэтилового эфира, и они перекрываются пробками, интенсивно встряхивают пробы на вихревом смесителе в течение 1 мин, центрифугируют пробы при ускорении ,1500-2000д в течение 2 мин, переносят 1 мл

эфирного экстракта в пробирки для анализа, которые затем помещают в водяную баню и полностью выпаривают з.фир при 37° С, Перед проведением экстракции определяют величину фонового тестостерона в анализе, которую дает используемый растворитель. Для этого определяют параметры связывания антисыворотки в калибровочной пробе без тестостерона в отсутствие (Во) м в присутствии (Вэф) сухого остатка после выпаривания 1 мл растворителя, Затем готовят 6 калибровочных проб тестостерона, используя соответствующий набор реактивов для радиоиммунологического определения тестостерона в сыворотке крови человека СТЕРОН-1-125 J.

С этой целью содержимое флакона с концентрированным буферным раствором переливают о стакан и добавляют 30 мл дистиллированной воды, перемешивают. .Затем во флакон с препаратом 125J тестостерона добавляют 11 мл буферного

(Л

С

00

о ел

Ьь

о

CJ

аствора, перемешивают до полного расворения, Для получения раствора антисы- оротки во флакон с этим препаратом обавляют 11 мл буферного раствора, перемешивают. Из флакона с раствором тестостерона в спирте (640 нг/мл) отбирают 0,1 мл и добавляют к 9,9 мл буферного раствора. Полученный раствор тестостерона является калибровочной пробой тестостерона, содержащей 6,4 нг/мл, Все остальные растворы калибровочных проб тестостерона, содержащие 3,2 нг/мл; 1,6 нг/мл; 0,8 нг/мл; 0,4 нг/мл; 0,2 нг/мл готовят путем соответствующего разведения буферным раствором первой пробы с 5,4 нг/мл.

Обозначают пробирки для общей активности (Т), фонового тестостерона (1,2), калибровочной кривой (5-16) и для анализа (17-102), В пробирки по определению общей активности (Т), фонового тестостерона (1-4), содержащие сухой остаток эфирного экс- тракта из анализируемой пробы (17-102), вносят по 0,1 мл буферного раствора.

В пробирки 5-16 вносят по 0,1 мл раствора соответствующих калибровочных проб тестостерона.. Во все пробирки вносят по 0,2 мл р-ра 2bJ и по 0,2 мл раствора антисыворотки, Тщательно перемешивают содержимое всех пробирок на вихревом смесителе,

Затем инкубируют все пробирки при комнатной температуре 18,25° С в течение 2 ч. Во все пробирки, кроме Т, приливают по 1 мл р-ра полизтиленгликоля, тщательно перемешивают на вихревом смесителе, в дальнейшем помещают пробирки в центрифугу с горизонтальным ротором и центрифугируют, все пробы при комнатной температуре в течение 15 мин при ускорении 1500-2000 д. После этого отсасывают надосадочную жидкость и измеряется скорость счета осадка каждой, пробирки в течение 1 мин в гамма- счетчике типа Гамма-1, Гамма-12. Находят среднее арифметическое значение скоростей счета и-)тестостерона, для каждой из 43 пар пробирок. Затем проводят расчеты и графическое построение согласно общеизвестной инструкции по применению набора реактивов CTEPOH-T-1/5J для ра- диоиммунологического определения тестостерона в сыворотке крови человека (утвержденной МЗ СССР 16 ноября 1984 г,). При переводе объемно-весовой концентрации тестостерона в молярную пользовались соотношением: нмоль тестостерона /л нг/мл тестостерона х 3,46.

С целью определения простэглэдмна Е к 1 мл сыворотки больных добавляют 3 эфира, после удаления которого добавляют 3 мл раствора, содержащего этилацетат,

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

изопропанол, 0,2 HCI в соотношении 3:3:1. Перемешивают и добавляют 2 мл этилацета- та и 3 мл дистиллированной воды. Перемешивают, центрифугированием раствор разделяют на фазы. Органическая фаза, 3 мл, переносится в полипропиленовую пробирку и высушивается в потоке воздуха под колпаком. Для разделения фракций про- стагландинов используется селикагелевая колонка. Далее нумеруют парные пробирки следующим образом:

TL Та - общие количества 1,2- неспецифический связывающий комплемент (NSB)

.3,4-содержащиестандарт PGBi, нг/мл (Во)

5, 6 - 1 /243 стандарта (8,2 нг/мл) 7, 8 - 1/81 стандарта (25 нг/мл) 9; 10 - 1 /27 стандарта (74 нг/мл) 11-12 - 1/9 стандарта (222 нг/мл) 13, 14 - 1/3 стандарта (667 нг/мл) 15-16-1/1 стандарта (2000 нг/мл) 17-18 - образцы проб больных. Для приготовления проб стандарта PGBi (40 нг/мл) вофлакон, его содержащий, добавить 1,0мл дистиллированной воды, 15 мин отстаивают, перемешивают. В пробирки, пронумерованные 1/3, 1/9, 1/27, 1/81. 1 /243,добавляют по 0,6 мл гелевого трис-бу- фера (к 100 мл трис-буфера добавляют 10 г желатины, нагревают, помешивая, до растворения желатины, остужают до комнатной температуры и доводят рН до 7,4, добавляя 0,1 П NaOH или HCI),

Исходному стандарту PGBi дают номер 1 /1, переносят 0,3 мл этого стандарта в пробирки 1 /3, перемешивают и 0,3 мл стандарта 1/3, переносят в пробирку 1/9, перемешивают. Продолжают это разведение до последней пробирки 1/243.

Затем в пробирки с NSB добавляют 1,1 мл гелевого трис-буфера, по 1 мл гелевого трис-буфера- в пробирки N 3-16 и по0,6 мл его - в пробирки с пробами больных, В соответствующие парные пробирки добавляют по 50 мкл каждого стандарта PGBi и по 0,4 МКЛ проб больных. Во все пробирки вносят по 50 МКЛ 3Н PGBi, входящий в набор реактивов для радиоиммунологиче- ского определения простогландинов и растворенный в 10мл гелевого трис-буфера. Во все пробирки добавляют по 50 МКЛ кроличьей анти-PGBi сыворотки, также входящей в данный набор реактивов и растворенной в 10 мл гелевого трис-буфера комнатной температуры. Содержимое пробирок перемешивают на вихревой мешалке. Инкубируют в водяной бане при 37° С в течение 60 мин. Во все пробирки, кроме П и Та, добавляют по 100 МКЛ нормальной

кроличьей сыворотки и по 100 МКЛ козьей аити-кроличьей сыворотки, входящих в набор реактивов для радиоиммунологического определения простогландшюв, Перемешивают на вихревой мешалке и инкубируют 18-20 ч при 2-8° С, Затем центрифугируют все пробирки, кроме Ti и Т2 .при 2-8° С в течение 30 мин при 1600 д. Изо всех пробирок, кроме Ti и Т2, полностью удаляют и ад- осадок. Высушивают пробирку снаружи и внутри, не задевая осадок/фильтровальной бумагой. Во все пробирки добавляют по 1,0 мл 0,1 П №ОН, перемешивают и растворяют осадок. Переливают растворы изо всех пробирок в соответствующие пронумерованные флаконы, туда затем добавляют по 11 мл сцинтилляционнойжидкости, перемешивают. Считают общую активность про- стогландинов в каждой пробе. Затем во все флаконы, включая Ti и Та, добавляют по 0,01 мл радиоактивного простогландима 3Н PGB, все перемешивают и результаты подсчитывают еще раз. Нормализированные СРМ должны быть использованы во .всех подсчетах по следующей формуле: нормализованное количество простогландинов в стандарте или образце (СРМ) подсчитывается по формуле

.СРМП СРМ х (Т1-Т) ,

(СРМ, -СРМП)

где Т-среднее отТч и Т; Т1 -среднее от Ti1 и Т2, т.е. Т - после измерения с Н, СРМ - количество простогландинов после добавления 3Н.

Для каждого стандарта подсчитывают % отклонения (Вп) по формуле

В 100 х

(СРМп MSB)

Be

где NSB - среднее арифметическое в пробирках 1 и 2, Bc B0-NSB. где В0 - средняя арифметическая в пробирках 3 и А.

Затем на полулогарифмической бумаге строят график, где по вертикальной оси откладывают %. отклонения PGBi, а по горизонтальной оси - концентрацию PGBi, строят кривую стандарта и, зная соответствующие % отклонения каждого контроля и образца, находят значения концентрации PGBi (нг/мл).

При значениях тестостерона 2 А нг/мл и более и 1,1 нг/мл и менее прогнозируют соответственно благоприятное и неблагоприятное течение болезни: у больных с показателями тестостерона в диапазоне ,1.2-2.3 нг/мл проводят определение

простогландина Е, при значениях которого 240 нг/мл и более прогнозируют неблагоприятное течение, 270 нг/мл и менее благоприятное,

5П р и м е р 1. У больного М. с диагнозом Древовидный герпетический кератит ра- . дио иммунологическим методом в сыворотке крови обнаружена концентрация тестостерона, равная 0,4 нг/мл. С этой

0 целью-использовали набор реактивов для радиоиммунологического определения тестостерона CTEPOH-1-125J. Исследование урооня тестостерона осуществляли по описанной выше методике. Согласно пр едлага5 емого нами способа мы прогнозировали затяжное течение инфекции. Действительно, заболевание приняло затяжное течение, не купировалось противовирусными средствами и продолжалось 45 дней.

0 Пример2,У больного Г. наступил рецидив поверхностного герпетического кератита на трансплантате роговицы. Измеренная концентрация тестостерона на 7 день заболевания равнялась 3,7 иг/мл. Про5 гноз офтальмогерпеса - благоприятное течение. На 27 день заболевания наступило выздоровление с благоприятным исходом без снижения остроты зрения.

Пример 3. У больных Н., Б., С, с

0 офтальмогерпесом показатели уровня тестостерона равнялись 1,2 нг/мл, 2,3 нг/мл и 2,2 нг/мл. Определение тестостерона проводили описанным выше радиоиммунологи- часким методом. К-онцентрация этого

5 гормона лежала в диапазоне 1,2-2,3 нг/мл. В этой связи был проведен анализ концентрации простогландина Е, определяемого в параллельных исследованиях, с помощью соответствующего набора реактивов. Пока0.затели его равнялись у вышеупомянутых больных соответственно 200 нг/мл, 350 иг/мл и 470 нг/мг. На основе предлагаемого нами способа прогноза офтальмогерпеса в первом случае заболевание должно было

5 иметь благоприятное течение, а во 2 и 3 - неблагоприятное, затяжное. В соответствии с прогнозом у больного Н. герпетический кератоувеит протекал благоприятно и через 20 дней наступило выздоровление, у боль0 них Б, и С. с древовидным герпетическим кератитом заболевание имело затяжное .

течение, протекало с осложнениями в виде наслоения вторичной инфекции и длилось соответственно 87 и 42 дня. В группе об5 следованных больных предложенным нами способом прогноз офтальмогерпеса был правилен в 94% ± 6 случаев. При этом прогноз офтальмогерпеса одновременно про- водили при изучении 43 образцов сывороток, взятых от 26 больных, что значительно повысило производительность труда лабораторного работника.

Формула изобретения Способ прогнозирования течения оф- тальмогерпеса у мужчин путем исследования крови больного, отличающийся тем, что, с целью повышения производительности за счет увеличения числа одновременно проводимых прогнозов, в пробе

крови определяют концентрацию тестостерона и при значении этого показателя 2,4 кг/мл и более прогнозируют благоприятное течение заболевания, при значении 1,1 кг/мл и менее - неблагоприятное, а при значении 1,2-2,3 кг/мл дополнительно определяют содержание простогландина Е и при его значении 340 мг/мл и более и 270 нг/мл и менее прогнозируют неблагоприятное течение заболевания,

Область применения; медицина, а именно офтальмология для прогноза течения оф- тальмогерпеса. Сущность изобретения: определяют в сыворотке крови концентрации тестостерона и простогландина Е и при значениях тестостерона 2,4 нг/мг и более и 1,1 нг/мг и менее прогнозируют соответственно благоприятное и неблагоприятное течение болезни; у больных с показателями тестостерона в диапазоне 1,2-2,3 нг/мг проводят определение простагландина Е, при значениях которого 340 нг/мл и более прогнозируют неблагоприятное течение, 270 нг/мг и менее - благоприятное. Применение способа в медицинской практике позволит увеличить число одновременно проводимых прогнозов.