Штамм бактерий BacILLUS роLYмYха - продуцент @ -амилазы Советский патент 1993 года по МПК C12N9/26 C12N1/20 

Изобретение относится к биотехнологии и представляет новый штамм бактерий, который может быть использован для производства ферментных препаратов, исполь- зуемых для получения мальтозных продуктов для медицинских целей, детского и диетического питания, а также для применения в пищевой промышленности, в частности в пивоварении, кондитерской промышленности, крахмалопаточной промышленности.

Целью изобретения является новый штамм бактерий, обладающий способностью к биосинтезу /3-амилазы на уровне прототипа на средах, содержащих недефицитные и дешевые компоненты, в комплексе ферментов которого отсутствуют а-амила- за и протеаза, что позволяет повысить качество мальтозных сиропов.

Это достигается тем, что новый штамм бактерий (хранится во Всесоюзной коллекции микроорганизмов - № В-5690) В. polymyxa F-12, выделенный из природных источников (почва), предлагается как продуцент /3-амилазы.

Преимущество предлагаемого штамма В. polymyxa F-12 заключается в том, что предлагаемый продуцент, обладая высокой способностью к биосинтезу -амилазы (на уровне прототипа), на средах, содержащих

00 О О

ю

00

со

недефицитные и дешевые компоненты, не содержит в комплексе ферментов я-амила- зу и протеазу, что обеспечивает высокое качество мальтозных сиропов, полученных при использовании препаратов /fr-амилазы предлагаемого продуцента. Кроме того, продуцент синтезирует в процессе культивирования экэополисахарид, обеспечивающий снижение потерь при выделении ферментных препаратов.

Штамм имеет следующие характеристики.

Морфологические признаки: спороносные, подвижные короткие тонкие прямые или слегка изогнутые палочки, размером 0,6±0.8 х 3-4 мкм. Одиночные или соединенные попарно. Споры овальные, расположены терминально.

Культуральные признаки: растет на твердых и жидких питательных средах, На синтетических средах рост слабый.

На картофельном агаре плоские, кремовые, слизистые колонии. К 24 часам роста - в виде легкого налета, к 48 часам - колонии хорошо развитые, слизистые.

На косяках (среда, содержащая 2% соевой муки, 5% крахмала, 2% агара) - колонии плоские, кремовые, слизистые, хорошо развитые.

На сусло-агаре-(8%-ном) рост затруднен.

На жидкой среде - 2% соевой муки, 5% крахмала, 0,3% КаНРСМ растет во всем объеме среды (при перемешивании), спорооб- разование начинается с 40-48 часов.

Физиологические признаки: аэроб, температурные границы роста 20-40°С, оптимальная температура роста 32-37°С; растет в диапазоне рН 5,5-9,0, оптимальное значение рН - 6,0-7,5,

Крахмал разжижает, клетчатку не разлагает. Ассимилирует: глюкозу, мальтозу, ра- финозу, арабинозу, ксилозу, маннит, сахарозу. Не ассимилирует: дульцит. Молоко коагулирует, желатину разжижает слабо. Нитраты разлагает до нитритов, индол и HaS не образует. На средах, содержащих 3-10% крахмала, способен к биосинтезу -амилазы на уровне 10-200 ед/мл в зависимости от состава сред и условий культивирования. На средах с высоким содержанием крахмала (3-10%) способен к образованию экзополисахарида (пол- имиксана).

«-амилаза отсутствует, глюкоамилаэа отсутствует, нейтральная протеаза отсутствует, поллуланаза отсутствует. Активность гидролитических ферментов определяли следующими методами:

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

1. Активность fi -амилазы - по Берн- фельду (Methods In Enzymol,, 1955, 1, №4, p. 149-150) при стандартных условиях: рН 7,0, , продолжительность 20 мин.

2. а-амилазная активность - ГОСТ 20264.4-74.

3. Протеолитическая активность - ГОСТ 20264.4-74.

4. Глюкоамилазная активность - ГОСТ 20264.4-74.

5. Пуллуланазная активность - пат. Англии Мг 1466009, опубл. 2.03.77 г.

Для уточнения природы фермента использовали методику построения голубой кривой (Biotechnol. Lett., 1988, 10, №2,143- 147). Голубая кривая В. polymyxa F-12 - аналогична голубой кривой для В. polymyxa 3 и растительной / -амилазы (sweet potato фирмы Sowa).

Пример 1. Штамм В. polymyxa F-12 выращивали на среде состава, %: 5 - крахмала, 1,5 - соевой муки, 0,3 - feHPO-i в ферментере объемом 10 л. Количество посевного материала 20 по объему. Культивирование осуществляли при 37°С, числе оборотов мешалки 4000 об/мин, воздух подавали в соотношении 151. Активность /3- амилазы к 30 часам составила 48 ед/мл. Активность «-амилазы и нейтральной про- теазы отсутствовала. Выход экзополисахз- рида 9 мг/мл. В контроле (Bacillus subtilis 2011, выращенном при аналогичных условиях на аналогичной среде) активность Д- амилазы 50 ед/мл, активность а-амилазы 0,2 ед/мл, активность нейтральной протеа- зы 0,2 ед/мл.

П р и м е р 2. Штамм В. polymyxa F-12 выращивали на качалочных колбах объемом 750 мл с 50 мл среды при температуре 37°С в течение 48 часов при 220 об/мин. Состав среды, %: 5 - кукурузного крахмала, 2 - соевой муки, 0,3 - КзНРСч начальное значение рН среды - 7,0. Посевным материалом служила 48-часовая культура бактерий, выращенная на картофельном агаре. Количество посевного материала - 4% по объему. Активность ft -амилазы в культуральной жидкости - 200 ед/мл, активность «-амилазы и нейтральной протеазы - отсутствует. Выход экзополисахарида - 17 мг/мл. В контроле (В. subtHls 2011), выращенной на такой же среде в аналогичных условиях 180 ед/мл, о-амилаза 0,5 ед/мл, нейтральная протеаза - 0,3 ед/мл.

Пример 3. Препарат / -амилазы В. polymyxa F-12 получали осаждением этиловым спиртом в соотношении 1:4 гтри рН 8,4, Т° 2-15 С. Контролем служили препараты В, subtilis 2011, полученные спиртоосаждением в соотношении 1:4. Результаты представлены в табл. 1.

Препараты / -амилазы, полученные из культуральной жидкости В. polymyxa F-12 с содержанием полисахарида 5-17 мг/мл имеют белый цвет, легко отсушиваются, имеют рыхлую консистенцию в сыром виде. Препараты, полученные из КЖ B.subtilis 2011 имеют бежевый цвет, мажущуюся консистенцию, трудно отсушиваются, что при- водит к увеличению потерь по активности.

Оптимум действия препаратов /3-ами- лазы В. polymyxa F-12: pH 6,0-7,0; Т° опт 55-60°С. Работает в диапазоне рН 4,5-9,0.

Оптимум действия препаратов В. subtills 2011: рН 7,0-7,5; Т° опт 55-63°С. работает в диапазоне рН 5,0-8,5.

Пример 4. Спиртоосаждение препараты Д-амилазы использовали для гидролиза нативного кукурузного крахмала из расчета 1 ед/г. Температура гидролиза 50°С, рН 7,0; 35% раствор кукурузного крах: мала предварительно разжижали препаратом а-амилазы (Амилосубтилин Г-10Х) из расчета 1 ед/г. Разжиженный субстрат име- ет следующие характеристики: ДЕ - 14,5%, мальтотриоза - 8,38%, мальтоза - 2,8%, глюкоза-0,12%.

На чертеже изображено изменение декстрозного эквивалента в процессе оса- харивания кукурузного крахмала препаратами / -амилазы.

Качественный и количественный состав мальтозных сиропов, оцененный методом высокоэффективной жидкостной хроматог- рафии представлен в табл. 2.

Оптимальная продолжительность гидролиза для препарата В. polymyxa F-12 составляет 12-18 часов, для препаратов В. subtills 2011 60-72 часа, объясняется высо- кой специфичностью фермента ft -амилазы В. polymyxa F-12 к кукурузному крахмалу.

Отсутствие в комплексе ферментов В, polymyxa 1-12 cz-амилазы определяет низкое содержание глюкозы, отсутствие нейтральной протеазы обеспечивает показатель цветности в 5 раз меньший, чем при использовании препаратов В. subtllis 2011.

Предлагаемый новый штамм В. polymyxa F-12 по сравнению с прототипом обладает преимуществами, заключающимися в том, что наряду с синтезом / -амилазы на уровне прототипа на средах с крахмалом названный продуцент не синтезирует/ -амилазу и нейтральную протеазу, что обеспечивает высокое качество получаемых мальтозных продуктов при переработке нативного крахмала: низкое содержание глюкозы - следы против 2-8% при использовании прототипа, высокое содержание мальтозы - 36-50% и высокий декстрозный эквивалент31-45%, против 18-35% мальтозы и 28-38% ДЕ для прототипа. Использование препаратов В. polymyxa 1-12 позволяет сократить время гидролиза с 60- 72 часов для прототипа до 12-18 часов. Способность предлагаемого продуцента синтезировать экзополисахарид на средах с крахмалом одновременно с / -амилазой, в отличие от прототипа обеспечивает снижение потерь по активности при выделении препаратов с 51 % до 37-41 %.

Новый штамм В. polymyxa 1-12 представляет продуцент со стойкими морфологическими признаками. Препараты / -амилазы В. polymyxa F-12, полученные из культуральной жидкости с активностью 10- 200 ед/мл могут иметь активность на уровне 250-25000 ед/г в зависимости от способа очистки.

Формула изобретения Штамм бактерий Bacillus polymyxa ВКПМ В-5690 - продуцент / -амилазы,

.Та б л и ц а 1

Таблица 2

Использование: биотехнология, штамм может быть использован для производства ферментных препаратов, используемых для получения мальтоэных продуктов для медицинских целей, детского и диетического питания, а также для применения в пищевой промышленности, в частности в пивоварении, кондитерской промышленности, крах- малопаточной промышленности. Сущность изобретения: штамм Bacillus polymyxa ВКПМ В-5690 выделен из природных источников и представляет продуцент со стойками морфологическими признаками. На средах с крахмалом продуцирует/ -амилазу на уровне 10-200 ед/мл. Технологические преимущества штамма заключаются в том, что наряду с синтезом / -амилазы штамм способен к синтезу на средах с крахмалом экзополисахарида - полимиксана, обладающего стабилизирующим действием по отношению к /3-амилазе. В комплексе сопутствующих ферментов отсутствуют а-амила- за и нейтральная протеаза. что обеспечивает высокое качество мальтозных сиропов. Препараты /б-амилазы, полученные на основе предлагаемого продуцента, могут широко использоваться при гидролизе крахмалсодержащего сырья с целью получения мальтозных продуктов, 1 ил., 2 табл. ё

Качественный и количественный состав гидролизатов при продолжительности

гидролиза 12 ч