Штамм @ фу-79,продуцент L-амилазы и протеазы Советский патент 1981 года по МПК C12N9/28 C12N9/56 

1

Изобретение о.тносится к микробио югической промышленности и касается получения штаммов-продуцентов cL-амилазы и протеазы.

Препараты, -содержащие oL-амилазу и протеазу, широко используются в народном хозяйстве: в животноводстве, пищевой, текстильной, бумажной промышленности.

Лучшим из известных в настоящее время продуцентов oL-амилазы, исполь зуемым в производстве, является штамм Вас.subtil is ВНИИ генетика-44 tl3.

Известно также, что некоторые штамзлы бацилл продуцируют наряду с dL-амилазой щелочную и нейтральную протеазы С2.

Существенным недостатком известных штаммов-продуцентов й--амилазы и продуцентов протеазы, в том числе и штаммов, принятых в качестве базовых образцов, является их чувствительность к производственным фагам.

В тех случаях, когда фаговый фон на производстве повышается, не исключены операции, сопровождающиеся лизисом культуры.

Цель изобретения - получение штамма-продуцента dL-амилазы к протеазы, обладающего широким спектром фагоустойчивости по отношению к специфическим фагам, встречающимся в производственных условиях, и не уступающего лучшим известным штаммам по основным производственным показателям: уровню ферментативной активности и скорости роста.

Новый штамм Вас. subtil is ФУ-79,

10 являющийся предметом предлагаемого изобретения, получен в результате селекции на фагоустойчизость к ряду выделенных образцов фагов среди потомства колоний, развившихся после

15 посева на газон фагочувствительного штамма Вас.subtil is 103, фаголизата из производственного ферменте)а, засеянного культурой штамма Bac.subtl1 Is У-43. .

20 Таким образом/ исходным дл}: получения предлагаемого продуцента oL-амилазы и протеазы штамма Вас. subtil is ФУ-79, является штамм Вас.subtil is 103. На производстве штамм

25 103 используется, как продуцент амилолитических и протеолитических ферментов. Предлагаемый штамм BacMtus subtil is ФУ-79 в зависимости от условий культивирования может проду30 .цировать d,-амилазу или протеазу. Штамм Bacillus subtills ФУ-79продуцент cL-амилазы и протеазы храпится в Центральном музее промышленных микроорганизмов Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов и имеет регистрационный № ЦМПМ В-1989. . Биологическая характеристика штам ма ФУ-79; Культурально-морфологические приз наки штамма Вас.subtil is ФУ-79. Морфология. Клетки штамма представляют собой грамположительные, спорообразующие палочки размером 1,7 3, 0)0, 4-0, 7 мк, .Размер спор; 1,0-1, XО,5-0,7 мк . Мясо-пептонный агар (МПА).Через 48 ч роста при на МПА культура образует беловатые; выпуклые, морщинистые колонии диаметром 2,5-4 мм. Мясо-пептонный бульон (МПБ). При выращивании в МПБ через 24 ч при 37°С без встряхивания на поверхности образуется морщинистая пленка. Рост без помутнения среды. При встряхивании на качалке среда мутнеет. При стоянии образуется пленка. Агаризованная среда Хоттингера. При выращивании в течение 24 ч при культура образует желтовато-се рые круглые, выпуклые, морщинистые колонии с лопастным краем диаметром 3,5-4,5 мм. На синтетической среде с минеральным азотом (среда Спецайзена). Культура растет в виде мелких,круглых колоний диаметром 1-2 мм сероват белого цвета,. На ломтиках картофеля культура образует морщинистую, складчатую пленку серовато-белого цвета. Со временем пленка ослизняется. Желатину разжижает. Крахмал гидролизует.Молоко пептонизирует. Отношение к источникам углерода. Глюкозу, лактозу, фруктозу,сахарозу усваивает. Хранение штамма производят в лиофильно высушенном состоянии в стеклянных ампулах. Предлагаемый штамм Вас.subtil is ФУ-79-продуцент oL-амилазы и протеазы отличается широким спектром фагоустойчивости. Штамм ФУ-79 стабильно сохраняет признаки фагоустойчивости, что было многократно проверено в ряде пересевов. В процессе роста он не отщепляет фагочувствительных клонов и не вытесняется фагочувствительным штаммом (например, У-43) в смешанно культуре. Помимо устойчивости к про изводственным фагам штамм Ваг, .subtil is ФУ-79 характеризуется тем,что достигает высокого уровня активности d-амилазы за более короткий срок ферментации (240 ед/мл за 44 ч), в то время как .штамм Вас.subtil is В-44, принятый в качестве базового образца (304 ед/Ш1 за 62 ч), а также более высокой активностью проте- азы по сравнению со штаммом Вас.subtil is-50. Для проверки ферментативной активности предлагаемого штамма ФУ-79 проводят опыты по глубинному культивированию его в качалочных колбах объемом 750 мл, содержащими 50 мп питательной среды. Для биосинтеза ci-амилазы штамм выращивают на среде следующего состава, %: крахмал осахаренный 10} СаСОо, 0,03t лактоза 0,3;K,lS04. 0,3; MgS04 0,015; NaCl 0,03; CuSOrj 0,00039; (NN4), HP04 О , 84; кукурузный экстракт 1,2, БВК 0,24; вода водопроводная (рН до стерилизации 7) 2. Число оборотов качалки 180 об/мин. Выращивание осуществляют при в течение 46 ч. .Амилолитическую активность в культуральной жидкости определяют по методу БЕРа. Для биосинтеза используют среду состава, %: крахмал осахаренный 8; СаСОз 0,05; MgS04 0,05; КС 1 0,15; ,01; (NH4)o.HP04 1,2 куку- . рузный экстракт 0,8; БВК 0,4 (рН до стерилизации 7) 4. Число оборотов качалки 220 об/мин. Выращивание осуществляют при в течение 44 ч. Протеолитическую активность определяют модифицированным методом Ансона (ГОСТ 20264.2-74}. Параллельно в этих же условиях выращивают штаммы Вас.subti1iS-103 и У-43. Амилолитическая (АС) и протеолитическая (ПС) активности- штаммов Вас. subtil is ФУ-79,103 и У-43 приведены в таблице. Из таблицы видно, что амилолитическая активность предлагаемого штам ма ФУ-79 превышает активность штаммов ).03 и У-43 на 66,6 и 11,2%, а протеолитическая активнбсть на 118,5 и 52,7% соответственно. Использование штамма Вас. subtil is ФУ-79 для получения i-амилазы и протеазы в производственных условиях. Пример 1, Посевной материал получ&ют выращиванием штамма Вас.sub tiiis ФУ-79 в колбах в виде пленки в жидкой питательной среде состава,%: крахмал 10; аммоний лимоннокислый 2-х замещенный 3 КН ,2 0,03; MgS04-7H/j O 0,15; CaSO 0,14; FeS04 0,002; MnSO. 0,000125; CuS04 0,00075; r. -аминобензойная кислота 0,001-, вода 86,2; рН 6,0-6,3. Температура . Полученным посевным материалом, составляющим 0,01% объема среды в ферментере, засевают аппарат .объемом 20 м с 10 м ферментацйон1ной среды следующего состава, %: крахмал осахаренный 22,5 (10% вносит ся сразу, остальное в виде подпитки) СаСО-ьО,03; NaCl 0,03; ОЗ; MgS04-0,015; С , 00039 ; БВК 0,24) (НН4)/г.НР040,84; кукурузный экстракт 1,2-пропинол (пеногаситель) 0,05, Ферментацию ведут при З7с с аэрацией в течение 44 ч. Культуральную жидкость с амилолитической активнос тью 240 ед/мл (колориметрический метод ГОСТ 20264.4-74) высушивают н распылительной сушилке. Выход готового продукта равен 72%. Пример 2. Штамм-продуцент и среда для приготовления посевного материала те же, что и в примере 1. Культивиоование проводят в ферментере объемом 20 м2 с 10 м ферментационной, .среды, %: крахмал осахаренный 13; СаСОз 0,05; КС 1 0,15;СаС.1( 0,01; MgS04.0,05; ( NH i)i НР04 1, 2 кукурузный экстракт 0,8; пеногаситель Пропинол 0,05; рН 6,6. Процесс ферментации идет при . с аэрацией в течение 38 ч. Культуральную жидкость, имеющую активность протеззы, равную 30 ед/мп, определенную по модифицированному методу .Ансона (ГОСТ 20265,2-74),высушивают на распылительной сушилке,. Выход су-кого продукта 60%, Таким образом, предлагаемый штамм Вас , subti1iS ФУ-78 может быть использован как продуцент oi.-амилазы от исходного штамма Вас.subtIlls 103 и других известных штаммов -продуцентов oL-амилазы и продуцентов протеазы широким спектром устойчивости к : фагам, распространенным на Вышеволоцком заводе, ряду фагов, выделенных на других ферментных заводах, ряду лабораторных штаммов фагов, специфичных для Вас.subtil is. Использование фагоустойчивости штамма ФУ-79 позволит обеспечить более стабильное производство ферментных препаратов. Кроме того, по сравнению с другими продуцентами, штамм Bac.subtiHs ФУ-79 Обладает более высокими уровнями активности i-амилазы и протеазы. Формула изобретения Штамм Bacillus subtMIs ФУ-79-прОдуцент ci-амилазы и протеазы. Штгичм хранится в Центральном музее промышленных микроорганизмов Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов и имеет регистрационный номзр ЦМПМ В-1989. Источники информации/ принятые во внимание при экспертизе 1,Авторское свидетельство СССР по заявке 2711504/13, кл. С 12 D 13/10, 1979. 2.Klay L.,Moser P.W. Biochetn, Biophys.Res.Commun.v.34, p.600-604,. 1969.