Способ получения инсулина Советский патент 1993 года по МПК A61K37/26 A61K35/39 

Изобретение относится к медицине, именно к эндокринологии, и может быть использовано в биотехнологии при получении лекарственных препаратов инсулина.

Цель изобретения - повышение выхода человеческого.инсулина и чистоты препарата, путем его накопления в среде процессом культивирования инсул инсинтезирующих эмбриональных клеток поджелудочной железы человека.

Поставленная цель достигается следующим образом: поджелудочную железу эмбрионов человека 14-28 недельного возраста извлекают стерильно, измельчают на фрагменты и культивируют In vitro в питательной среде в ротационной установке. Ростовую среду с синтезированным в ней, растущими / -клетками поджелудочной железы инсулином центрифугируют для удаления шлакоа. супернатант отделяют. С целью стабилизации инсулина от разрушения, супернатант замораживают при температуре -18°С. Су- пернатанты собирают неоднократно в течение всего периода культивирования до физиологической гибели клеток (20-25- дней). Все супернатанты размораживают, объединяют и радиоиммунологическим методом определяют в нем содержание инсулина. Супернатант вновь замораживают и лиофилизируют. Полученный сухой порошок и является целевым продуктом. Перед употреблением содержимое флаконов разводят дистиллированной водой и целевой продукт употребляют е нативном виде. (В зависимости от задач исследований супернатант может быть разлит по флаконам с заведомо известным содержанием инсулина). В лиофилизированном состоянии целевой продукт можно хранить и использовать в течение года.

Способ осуществляют следующим образом: поджелудочную железу эмбрионов человека 14-28-недельного возраста извлекают стерильно, измельчают на фраг- . менты вели-чиной 2-3 мм3 и культивируют в ростовой среде, в объеме 3-5 мл, состоящей

ел

с

00

о

о %| ел

из среды Игла с 10% сыворотки крови человека. Среда Игла содержит набор аминокислот на сбалансированном солевом растворе и оптимально приближена к биологической среде клеток организма, Все это потребляется клетками для своей жизнедеятельности в процессе роста. Культивирование проводят в ротационной установке (в аппарате для культивирования тканей во вращающихся пробирках). Ростовую среду собирают после осаждения фрагментов поджелудочной железы путем центрифугирования при скорости 500 об/мин в течение 5 мин. Супернатанты отделяют, а к осадку фрагментов поджелудочной железы добавляют 3-5 мл свежей питательной среды для дальнейшего культивирования. Ростовую среду с растущих культур собирают многократно, каждые 3-4 дня, во время реновации среды в культурах, в течение всего периода культивирования (20-25 дней) и хранят при температуре-18°С. Супернатанты размораживают, объединяют и центрифугируют при 15000 об/мин в течение 30 мин для осаждения шлаков и элементов разрушенных клеток. Радиоиммунологическим методом в супернатанте определяют содержимое ин- сулина набором (Cia-ire-Sorin) Франция. Су- пернатант с известным содержанием инсулина разливают по флаконам, вновь замораживают и лиофилизируют. От одной поджелудочной железы в течение 25-дневного культивирования можно получить сухого вещества 246-250 мг с активностью ИРИ от 300-500 мед/мг инсулина. Неиспользованные клетками компоненты ростовой среды, вошедшие в сухой целевой продукт, во внимание не принимают, т.к., являясь оптимально приближенными к биологической среде клеток организма, они не могут вызывать побочных явлений. Перед употреблением содержимое флаконов с заведомо известным содержанием инсулина разводят дистиллированной водой, в зависимости от задач исследований, и употребляют в нативном виде.

В опытах было использовано 11 поджелудочных желез плодов человека разного возраста. Сливы с культур брались в динамике роста культур.

Пример 1. Культура № 2 от 25/IV-89f.

Одну поджелудочную железу эмбриона человека 14 недельного возраста извлекают стерильно, измельчают на фрагменты величиной 2-3 MM3J и культивируют в питательной среде Игла, содержащей 10% человеческой сыворотки в объеме 3 мл в ротационной установке. Каждые 4-е сутки культивирования центрифугированием при

500 оборотов в минуту в течении 5 мин су- пернатант отделяют и замораживают при температуре -18°С, а к осадку добавляют 3 мл свежей питательной среды для дальнейшего культивирования фрагментов поджелудочной железы. За 25 сут культивирования, во время реновации среды в культурах фрагментов поджелудочной железы, было собрано и заморожено 5 су0 пернатантов. Собранные Супернатанты раз- мораживались, объединялись и центрифугировались при 15000 об/мин в течении 30 мин, после чего радиоиммунологи- ческим методом определяли в нем

5 содержание инсулина. Супернатант с известным содержанием инсулина замораживают и лиофилизируют. После лиофилизации супернатанта с одной поджелудочной железы всего получено сухого порошка 246 мг с

0 активностью ИРИ 295 мед/мг.

Пример 2. Культура № 1 от 5/XII-89 г. Поджелудочную железу эмбриона человека 28-недельного возраста извлекают сте- рильно, измельчают на фрагменты

5 величиной 2-3 мм3 и культивируют в питательной среде Игла, содержащей 10 % человеческой сыворотки в объёме 3 мл в ротационной установке. Каждые 4-е сутки культивирования супернатант, центрифуги0 рованием 500 об/мин в течение 5 мин. отделяют и замораживают при. температуре -18°С, а к осадку добавляют 3 мл свежей питательной среды для дальнейшего культивирования фрагментов поджелудочной

5 железы. За 25 сут культивирования собрано и заморожено 5 супернатантов. Собранные Супернатанты размораживались, объединялись и центрифугировались при 15000 об/мин в течение 30 мин, после чего радио0 иммунологическим методом определяли в нем содержание инсулина. Супернатант с известным содержанием инсулина замораживают и лиофилизируют.

После лиофилизации супернатанта все5 го получено сухого порошка 250 мг с активностью ИРИ 480 мед/мг.

Как видно из примеров, количество инсулина, синтезированного одно й поджелудочной железой, колебалось, что,

0 по-видимому, связано с возрастом плода и величиной поджелудочной железы.

Данный способ дает возможность пол- учить от одной поджелудочной железы целевой продукт в виде сухого порошка с

5 активностью инсулина до 500 мед/мл, что в 10000 раз превышает активность препарата по известному способу, кроме того, предлат гаемый способ не требует очистки препарата, который может быть использован в нативном виде.

Сухое вещество, полученное из супер- нэтанта подвергали биологическому тестированию на инсулин, который при введении животным снижает сахар в крови, вызывает гипогликемические судороги и гибель животных. Судорожный тест был поставлен на 20 белых мышах и на 10 крысах с аллрксано- вым диабетом, у которых сахар крови составлял 300-400% мг. Лиофилизированный порошок предварительно разводили дистиллированной водой до концентрации ин- сулина 40000-50000 мкед/мл, которая вызывала четкий судорожный эффект и гибель животных. Гипогликемический эффект наблюдался у крыс с аллоксановым диабе- том при введении им целевого продукта в количестве 5000:6р 6о мкед/мл, что еще раз явилось подтверждением наличия инсулина в порошке, обладающего биологической активностью.

Таким образом, в 1 мг, получаемом по данному способу сухом порошке, активность человеческого инсулина в 10000 раз выше, чем по известному способу. Биологическое тестирование и радиоиммунологиче- ские данные подтвердили это. Человеческий инсулин, полученный данным способом, может быть использован как препарат в нативном виде, т.к. незначительные примеси, являясь компонентами ростовой среды, максимально приближенные к биологической среде организма, не могут вызывать побочные явления в организме человека, по сравнению с известными препаратами инсулина.

Заявленный способ может быть использован:

при изготовлении стандартных форм инсулина человека для радиоиммунологиче- ских наборов; ,

технология данного способа может быть использована в лабораторных условиях для получения инсулина всех видов животных;

полученный данным способом лиофили- зированный порошок, содержащий инсулин, может быть использован без очистки в нативном виде, как биостимулятор в клинической практике при заживлении ран;

возможность получения гормоноактив- ных временных линий из эмбриональных поджелудочковых желез, установленная в той же лаборатории, позволит перспективе накапливать человеческий инсулин, применение которого позволит избежать осложнений и сложных иммунологических реакций в организме больного, присущих применяемым сейчас, представленным препаратам инсулина.

Предлагаемый способ прост и доступен, не требует сложного оборудования, ценного продукта - крови человека, исключает процесс очистки.

Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я

Способ получения инсулина из поджелудочной железы человека путем измельчения исходного сырья, очистки, охлаждения с последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем. что, с целью упрощения способа, повышения выхода и специфической активности целевого продукта, в качестве сырья используют ткань поджелудочной железы 14-28 недельных эмбрионов человека, культивируют ее в питательной среде Игла с добавлением 10%- ной сыворотки крови человека в ротационной установке в течение 3-25 дней, смесь центрифугируют 5 мин при 500 об/мин, надосадочную жидкость, содержащую целевой продукт, собирают, ззморажи- вают при температуре -18°С, размораживают, повторно центрифугируют 30 мин, при 15000 об/мин и лиофилизируют замороженные супернатанты.

Изобретение относится к медицине и медицинской промышленности, а именно к способам получения инсулина. Цель изобретения - повышение выхода специфической активности целевого продукта и упрощение способа. Поставленная цель достигается тем, что в качестве сырья используют ткань поджелудочной железы 14-28-недель- ных эмбрионов человека, культивируют ее в питательной среде Игла с добавлением 10% сыворотки крови человека в ротационной установке в течение 3-25 дней, смесь центрифугируют 5 мин при 500 об/мин, надоса- дочную жидкость собирают, замораживают при минус 18°С, размораживают, повторно центрифугируют 30 мин при 15000 об/мин с последующей лиофилизацией замороженных супернатантов.