СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РОДОСПЕЦИФИЧЕСКОГО АНТИГЕНА ЛЕПТОСПИР Российский патент 2000 года по МПК A61K39/02 G01N33/531 C12N1/20 

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в биотехнологии изготовления диагностических препаратов. Основные требования к технологии извлечения комплекса антигенов из микроорганизмов заключаются в обеспечении нативности в сочетании с высокой специфичностью и активностью получаемых антигенов.

Извлечение антигенных компонентов из микробной клетки проводится путем ее разрушения химическими, физическими, механическими способами (экстракция, ультразвуковая дезинтеграция, экструзия).

Известно, что водносолевые экстракты чумных микробов обладают наиболее сложным макромолекулярным составом и содержат в тех или иных количествах все выявленные у чумных микробов антигены [Бельская Н.А. и др. Материалы Северо-Кавк. биохимической конференции. - Махачкала, 1970, с. 270 - 271].

Сравнительное изучение белковых фракций кишечных бактерий, полученных водносолевой экстракцией (NaCl) и изолированных трихлоруксусной кислотой (липосомальная суспензия ЛПС), показало, что белковые фракции более сложны по составу и иммунологически более активны, чем ЛПС [Тимаков В.Д., Скавронская А.Г. ЖМЭИ. - 1961. - N 3. - С. 3 - 9]. Результаты исследований свидетельствуют о том, что белковые компоненты бактериальных клеток во многом определяют их серологическую специфичность, иммунологическую активность.

По своей морфологической структуре клеточные стенки лептоспир сходны с таковыми у граммотрицательных бактерий, которые состоят из липопротеидов, липополисахаридов и подлежащих белковых и мукопептидных слоев.

Несмотря на то, что все патогенные и сапрофитические лептоспиры имеют одинаковую морфологию, между ними существуют серологические различия, что выражается в наличии многочисленных серотипов.

С целью изолирования типо- и родоспецифических антигенов культуры патогенных и сапрофитических лептоспир подвергали разрушению ультразвуком. При иммунохимическом анализе препаратов выяснилось, что антигенная функция ультразвукового антигена лептоспир связана с его белковой фракцией. В клетках лептоспир различных серотипов обнаружены также преципитиногены. Они обладали высокоспецифическими свойствами. По своей природе они сложны и представлены в различных сочетаниях у различных серотипов и даже у отдельных штаммов одного и того же серотипа лептоспир.

Ультразвуковая дезинтеграция позволила получить из лептоспир антигены, способные сенсибилизировать бараньи эритроциты, которые под воздействием антилептоспирозных сывороток могут агглютинироваться и лизироваться. Гемолитические антигены, выделенные из сапрофитических лептоспир, проявляли родоспецифическое родство, а антиген из патогенного штамма проявлял родство как с патогенными, так и с сапрофитичными лептоспирами [Лептоспирозы людей и животных./ Под ред. В.В.Ананьина. - М.: "Медицина", 1971, с. 86 - 87].

Наиболее близким по существу и назначению к заявленному является способ получения родоспецифического антигена лептоспир с целью повышения его специфической активности [Adler B.et. al. - J.Clin. Microbiol., 1970, VII, N 5, p. 452 - 457].

Способ включает культивирование бактериальной массы, осаждение, дезинтеграцию ультразвуком с последующим центрифугированием и определением концентрации белка.

Недостатками прототипа являются недостаточная специфическая активность получаемых антигенов, низкая эффективность технологического процесса по выходу и себестоимости готового продукта.

Эти недостатки обусловлены следующими факторами.

В основе физических методов дезинтеграции (ультразвуковые дезинтеграторы, экструдеры, планетарные мельницы) заложен универсальный механизм высокоградиентных течений жидкости с силами, действующими в зоне дезинтеграции порядка 10⁵ дин/см².

В частности при ультразвуковой дезинтеграции создается высокий локальный градиент давления, в результате клетки разрушаются под действием напряжения сдвига и кавитации [Эльницер и др. Микробиология, 1955, т. 24, вып. 1, с. 371 - 381].

В ультраозвучиваемой водной среде вследствие возникновения в кавитационных областях электрического напряжения образуются продукты расщепления ионизированных молекул воды - свободные гидроксильные радикалы и атомарный кислород. Эти продукты инициируют распад аминокислот и белка, деполимеризацию нуклеиновых кислот, инактивацию ферментов, расщепление пуриновых соединений и других биологически активных веществ.

Целью изобретения является повышение специфической активности антигена за счет щадящего режима дезинтеграции, увеличение выхода и снижение себестоимости готового продукта.

Поставленная цель достигается тем, что способ включает культивирование одного или комплекса патогенных штаммов лептоспир, дезинтеграцию бактериальной массы путем глубокого замораживания суспензии с последующей экструзией, центрифугирование, экстракцию осадка 2,5% раствором натрия хлористого, центрифугирование и осаждение смеси первого и второго супернатантов раствором сульфата аммония.

По отношению к прототипу заявляемый способ имеет следующие отличительные признаки.

Проведение дезинтеграции бактериальной массы путем глубокого замораживания с последующей экструзией создает оптимальные условия выделения антигенных комплексов с сохранением их нативности, что обеспечивает повышение специфической активности антигенов.

Экстракция осадка 2,5% раствором натрия хлористого и выделение второго супернатанта позволяет в максимальной степени использовать возможности бактериальной массы, обеспечивает повышение выхода целевого продукта и снижение его себестоимости.

Фракционирование антигенов из супернатантов сульфатом аммония кроме эффектов концентрирования и очистки имеет одно важное преимущество по сравнению практически со всеми другими методами - оно приводит к стабилизации белков: суспензия белкового осадка в 2-3 М растворе сульфата аммония стабильна в течение многих лет [Скоупс Р. Методы очистки белков. - М.: Мир, 1985, с. 40].

Возможность промышленного использования заявляемого способа подтверждается примерами его конкретного выполнения с использованием полной совокупности заявляемых признаков.

Пример. Для получения лептоспирозного антигена используют бакмассы патогенных лептоспир L. Icterohaemorragiae, Grippothyphosa, Pomona, Hebdomadis, Tarassovi, Canicola, выращенные на среде Ферворта-Вольфа при 28^oC в течение 7-10 сут., концентрацией 80-100 м. кл. в поле зрения, обеззараженные мертиолатом натрия.

Смесь, состоящую из равных пропорций культур лептоспир, общим объемом 1200 мл центрифугируют при 15000 g 45 мин. при 4^oC. Супернатант отбрасывают, а осадок ресуспендируют в исходном объеме забуференного физиологического раствора (ЗФР) 7,2 и центрифугируют 3 - 4 раза с целью более полного освобождения от белковых компонентов, содержащихся в среде культивирования.

Осадок, полученный после центрифугирования бакмассы, суспендируют в ЗФР pH 7,2 (1 : 1). Для разрушения клеток и извлечения антигена полученную суспензию помещают в камеру X-пресс дезинтегратора, предварительно охлажденного в течение 2 ч при минус 40 - 50^oC. Микробные клетки в дезинтеграторе замораживают при минус 40 - 50^oC не менее 12 ч. После этого разрушают клетки на гидравлическом прессе под давлением 2000 мГ/см². Далее бакмассу размораживают и центрифугируют вышеуказанным способом. Получают антиген, находящийся, преимущественно, в супернатанте.

Осадок, полученный после центрифугирования дезинтегрированных клеток, суспендируют в растворе хлорида натрия в концентрации 2,5% и экстрагируют антигенные комплексы в течение 48 ч при постоянном перемешивании на магнитной мешалке.

После центрифугирования при 20000-22000 g в течение 45 мин супернатанты смешивают. К полученному объему добавляют сульфат аммония до 80% насыщения и помещают на 16 ч в холодильник при 4^oC для формирования осадка и стабилизации белка. В таком виде лептоспирозный антиген может сохраняться в течение длительного времени (годы).

Далее центрифугируют указанным способом, супернатант отбрасывают, а осадок растворяют в ЗФР pH 7,2 в соотношении 1 : 1 и помещают в диализные мешки на диализ против дистиллированной воды при 4^oC. Через 24 ч концентрируют (при необходимости) полиэтиленгликолем 20000, определяют содержание белка, разливают по ампулам и лиофилизируют.

Таким образом, изобретение практически осуществимо, его использование создаст необходимый набор микробиологических препаратов с достаточной специфической активностью для осуществления надежного и своевременного мониторинга водных сред и медицинской диагностики.

Изобретение относится к микробиологии. Для повышения специфической активности антигена, увеличения выхода и снижения себестоимости готового продукта способ включает культивирование одного или комплекса патогенных штаммов лептоспир, дезинтеграцию бактериальной массы путем глубокого замораживания суспензии с последующей ее экструзией, центрифугирование, экстракцию осадка 2,5% раствором натрия хлористого, центрифугирование и осаждение смеси первого и второго супернатантов раствором сульфата аммония. Изобретение может быть использовано в биотехнологии для приготовления диагностических препаратов.

Способ получения родоспецифического антегина лептоспир, включающий культивирование патогенного штамма, дезинтеграцию бактериальной массы, центрифугирование, выделение целевого продукта, отличающийся тем, что культивируют один или комплекс штаммов, дезинтеграцию бактериальной массы проводят путем глубокого замораживания суспензии с последующей ее экструзией, после центрифугирования осадок дополнительно подвергают экстракции 2,5% раствором натрия хлористого, центрифугированию и смесь первого и второго супернатантов осаждают насыщенным раствором сульфата аммония.