Штамм гибридных культивируемых клеток MUS мUSсULUS - продуцент моноклонального антитела к антигену @ -клеток поджелудочной железы с мол.м. 64 КД Советский патент 1992 года по МПК C12N5/00 A61K39/395 

Изобретение относится к гибридной технологий и может быть использовано в медицине для изучения патогенеза инсулинзависимого сахарного диабета и иммунодиагностики.

Цель изобретения - повышение специфичности моноклонального антитела.

Штамм получают следующим образом.

; ..

Мышей линии BALB/C иммунизируют вНутрибрюшйнно 2-10 островковых клеток, полученных при переваривании коллагеназой-трипсином поджелудочных желез новорожденных красят Вистар. Через 24 дня иммунизацию повторяют аналогичным способом, а через 14 дней вводят те же клетки внутривенно. Спустя еще 4 дня клетки селезенки иммунных мышей сливают с клетками мышиной миеломы РЗ-Х6Х-Ад8.653 с помощью 50%-ного полиэтиленгликоля с

мол.м. 1500. Соотношение клеток селезенки и клеток миеломы 5:1. После гибридизации клетки высевают в 96-луночные пластинки по 10 клеток на лунку, в которую предварительно были высеяны перитониальные макрофаги мыши BALB/C по 10 клеток на лунку. Селекцию гибридомы ведут в минимальной среде Игла, модифицированной Дульбекко, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 10 М гипоксантиг5

v7

на, 4-10 М аминоптерина и 1,6-10 М тимидина. Гибридому дважды клонируют из расчета 1 1слетки на лунку. Доля клонов, сохранявших продукцию антител заданной специфичности, не ниже 90% при обоих клонированиях.

Штамму дано условное название C10G7, депонирован под номером ВСКК(П) Nfe 251D и характеризуется следующими признаками.

Культуральные признаки.

Среда для культивирования - минимальная среда Игла, модифицированная Дульбекко, содержащая 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2тМ L-глютамина, 100 ед/мл гентамицина и 5 10 М 2-меркаптоэтанола. Оптимальная концентрация клеток при культивировании 510 клеток/мл. Посевная доза 10 клеток в мл. Время субкультивирования 3-4 дня. Гибридома хорошо живет и размножается в стандартных условиях для культивирования исходной миеломы. Клетки выдерживают семидневное культивирование без смены питательной среды при исходном засеве 50-10 клеток/мл с постепенным снижением жизнеспособности до 20-30% после периода максимального нарастания. Время удвоения культуры, определенное путем прямого подсчета количества клеток в 1 мл суспензии, меняется от 24 до 78 ч в зависимости от условий культивирования.

Культивирование In vivo,

При пассировании гибридомы на мышах BALB/сдоза клеток при прививкебЮ клеток. .Время образования ацита 8-12 дней. Гибридома сохраняет продукцию антител в течение 30 пассажей в культуре и 20 пассажей на мышах BALB/c, обработанных пристаном за 10 дней до введения гибридомы...

Морфология клеток штамма C10G7.

Клетки однородны по размерам, округлой формы. Большинство клеток имеет округлое ядро. Ядра крупные, располагаются преимущественно h центре клеток или несколько смещены к периферии. Ядра занимают большую часть объема клеток. Цитоплазма узким ободком располагается вокруг ядра. При окраске по РомановскомуГимза ядро имеет красновато-фиолетовую окраску цитоплазма - голубую окраску. Включений в цитоплазме не наблюдается.

Характеристика полезного продукта.

Моноклональные антитела (монАТ), продуцируемые штаммом C10G7, специфически реагируют с антигеном/ клеток поджелудочно железы с мол.м. 64 КД; монАТ не реагируют с клетками крови, тимоцитами, спленоцитами, клетками щитовидной и слюнной железы, ацйнарной тканью поджелудочной железы, клетками печени. Изотип антитела - YgG2b.

Контаминация. Контаминации бактериями, грибками и микоплазмами не обнаружено.

Консервация клеток.

Гибридому криоконсервируют в | ультуральной среде, содержащей 50% эмбриональной телячьей сыворотки и 10% диметилсульфоксида. Режим замораживания: 1 градус в мин, до -70°С, далее клетки переносят в жидкий азот. Размораживают гибридому при переносе ампулы с клетками из жидкого азота в водяную баню при 37°С.

Жизнеспособность клеток после хранения в жидком азоте около года не ниже 70%, судя по включению красителя зозина и трипанового синего.

Использование штамма иллюстрируется следующими примерами.

П р и м е р 1. Гибридому высевают при плотности 510 клеток/мл в пластиковый флакон с минимальной средой Игла, модифицированной Дульбекко, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2тМЬ-гяютамина, 100 ед/мл гентамицина и 5-10 М 2-меркаптоэтанола. Клетки культивируют 3-4 дня при в атмосфере с 5% С02. Далее культуральную жидкость собирают, центрифугируют при 3000 об/мин 20 мин, а супернатант используют в качестве источника антител.

Поджелудочные железы 40 новорожденных крысят Вистар обрабатывают коллагеназой-трипсином, затем трипсином-ЭДТА-ДНКазой. Клетки помещают в среду Игла в модификации Дульбекко с 10% телячьей сыворотки эмбриональной и культивируют при 37°С 24 ч в атмосфере с 5% СОа на пластиковых чашках Петри. Затем клетки снимают с чашек Петри и отмывают буфером без кальция и магния. Клетки подсчитывают в камере Горяева. 10 клеток инкубируют 30 мин при 37°G в среде, из которой затем берут пробу на продукцию инсулина. Уровень базальной секреции инсулина на 10 островковых клеток составит 560±65 мкг/мл. После контроля на активность, 0,510 островковых клеток инкубируют 30 мин при 4°С в 50 мкл раствора монАТ. Клетки 2 раза отмывают, центрцфугируя при 1000 об/мин 10 и суспендируют в 50 мкл кроличьих антимышиных антител, конъюгированных с изотиоцианатом флуоресцеина. Через 30 мин инкубации при А°С клетки отмывают, суспендир|уют в 100 мкл 1% параформальдегида. Флуоресценцию регистрируют с помощью проточного цитометра. Долю светящихся клеток определяют при просчёте 20000 островковых клеток.

При 30 кратном скриннинге на культивируемых островковых клетках обнаружено; связывание 7б±6,1 % клеток с монАТ, продуцируемого гибридомой ciOG7.

П р и м е р 2. Фрагмент поджелудочной железы 0,5x0,5 см замораживают в жидком азоте. Затем переносят в охлажденную камеру криостата при 20°С и изготавливают криосрезы толщиной 6-8 мкм. Каждый срез наносят на стекло с 50 у поли-1-лизина и фиксируют в течение 1 с нагреванием до 36°С. Срезы фиксируют в безводном ацетоне 7-10 мин. Зате|уг переносят в раствор Трис-NaCI и инкубируют 5 мин. Срезы переносят во влажную камеру, наносят по 50 мкл супернатанта гибридом C10G7 и инкубируют 60 мин при комнатной температуре. Затем трижды отмывают по 5 мин погружением в сосуд с Трис-NaCI. После этого на срезы наносят по 50 мкл кроличьих антимышиных антител, конъюгйрованных с пероксидазой, и инкубируют 60 мин при комнатной температуре. Повторяют отмывку указанным способом. Проводят под контролем зрения докраскудиаминобензидином. Продукт иммунопероксидазного окрашивания островковых клеток с монАТ учитывают на световом микроскопе. При 20 кратном скриннинге на. срезах поджелудочной железы обнаружено окрашивание кЛеток, находящихся в зоне расположения/ -клето к. П р и м е р 3. Срезы поджелудочной железы получают как описано в примере 2. Срезы обрабатывают монАТ к инсулину, и монАТ, полученными из штамма C10G7. Далее срезы отмывают, обрабатывают кроличьими антителами, конъюгированными с пероксидазой, и регистрируют окрашивание/б-клетрк так же, как в примере 2. В результате проведенных опытов показано, что монАТ, продуцируемое гибридомой C10G7, специфически реагируют с мембранным антигеном с мол.м. 64 КД островксвых клеток поджелудочной железы крысы и человека. Для выяснения природы островковь1х клеток, несущих антиген с мол.м. 64 КД проведено сопоставление окрашивания клеток мои AT к инсулину. В. результате показано, что MOHAJ к инсулину и монАТ к антигену реагируют с одними и теми же клетками островков Лан-герганса: монАТ к антигену с поверхностью, а мЬнАТ к инсулину - с цитоплазмой уЗ клеток. Антиген, выявляемый антителом, секретируемым штаммом G10G7, обнаруживается только на инсулинпродуцирующих клетках поджелудочной железы как человека, так и крысы. Данный антиген имеет мол.м. 64 КД. Известно, что в сыворотке больных сахарным диабетом I типа присутствуют антителак этому антигену и антиген является органоспецкфическим и патогенетическим маркером этого заболевания. Таким образом, штамм секретирует моноклональное антитело, выявляющее антиген с мол.м. 64 КД, имеющий решающее значение в развитии аутоиммунного компонента при заболевании инсулинЗависимым сахарным диабетом, с помощью продуцируемого штаммом монАТ удается выделить антиген, сферический для инсулинпродуцирующих клеток поджелудочной железы, и тем самым в дальнейшем проводить иммунодиагностику сахарного диабета I типа. Формула изобретение Штамм гибридных культивируемых клеток Mus musculus ВСКК(П) № 251D - продуцент моноклонального антитела к антигену клеток поджелудочйой 1 елезы с мол.м. 64 КД.

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано вмедицине для изучения патогенеза инсу- линзависимого сахарного диабета и иммунодиагностики. Цель изобретения - повышение специфичности моноклонально- го антитела. Полученный штамм гибридрмы C10G7 депонирован под номером ВСКК (П) Ns 251D. Штамм продуцирует моноклональ- ное антитело изотипа УдС 2, при этом продукция антител сохраняется в течение 30 пассажей в культуре и 20 пассажей In vtvo. Антитело обладает специфичностью к антй- гену /8-клето1$. поджелудочной железы с мол.м. 64 КД. С антителом связывается 76±6,1% "культивируемы)? островковых клеток..