Способ получения диагностических сывороток к вирусам растений Советский патент 1984 года по МПК C12N7/00 A61B10/00 

О)

со со

о

4 Изобретение относится к фитовир сам, преимущесгвенно к серодиагнос тике и может быть использовано в сельском хозяйстве, в области защиты растений, в селекционных и семеноводческих хозяйствах, конкретно - для приготовления диагностических сьюороток, служащих для диагностики вирусных заболеваний растений. В настоящее время для приготовления сывороток к фитопатогенным вирусам в качестве антигена исполь зуютря,главным образом, очищенные препараты. Наиболее широко рас- пространенным является способ дифф ренциального центрифугирования в сочетании с химическим методом очистки Процесс очистки, как правило, сложен и длителен: ряд предварительных обработок исходного матери ла с целью освобождения от балласт ных веществ - белков хозяина, пигментов, структурных компонентов клеток и т.п., несколько циклов ди ференциального центрифугирования (один цикл состоит из осаждения вируса в ультрацентрифуге, суспендирования осадка в буферном растворе и /меренного центрифугирования) . Очистка вируса требует дорогостоящего оборудования и наличия высококвалифицированных специалистов. При современном уровне препаративной техники очистить полностью препарат вируса от антигено хозяина не представляется нозможным. При недостаточном освобождении вирусного препарата от белков растения специфичность сьюоротки не обеспечивается. Кроме того, в процессе очистки зачастую теряется значительная часть вирусного материала поэтому для очищенного антигена требуется переработать большую массу исходного растительного материала. Известно использование в качест ве антигена неочищенного экстраги рованного сока СзЗ. Способ состоит в следующем. Листья зараженных вирусом растений растираются с буфером, гомоге нат центрифугируют (3000 об/мин, 10 мин), супернатант смешивается с. приготовленной заранее сывороткой специфичной к белкам здорового растения- хозяина, в равных количествах для осалодеиия анти-. генноактивных веществ хозяина.Затем осадок удаляется центрифугированием, а супернатант, содержапщй вирус, служит антигеном для получения антисыворотки к вирусу. Титры сывороток к Х-вирусу картофеля (ХВК), полученных этим способом, колеблятся в пределах от 1:128 до 1:512, а сьшоротка к вирусу мозаики оси (ВМС) имеет невысокий титр. При использовании в качестве антигена неочищенного экстрагированного сока из листьев зараженных растений сыворотка получается неспецифичной. Серологический метод приготовления антигена предлагает адсорбцию из сока больного растений белков самого растения антителами к ним. Следовательно, для приготовления вирусного антигена требуется сыворотка, специфичная к белкам здорового растения, на которой необходимо затратить дополнительное время и средства. При наличии такой сыворотки с низким титром антител для полного осаждения белков растения следует добавлять значительные объемы этой сыворотки, что приводит к большему расходу сыворотки, сильному разбавлению антигена и, в конечном итоге, к получению антивирусной сьгаоротки с низким титром. Кроме того, существует опасность неполного осаждения белков растения - хозяина, а, значит, возможность получения неспецифической сыворотки. Цель изобретения - повьппение специфичности сьгеороток в качестве ткани, на которой размножают вирусы. Это достигдется предлагаемым способом полз- ения диагностических сывороток к вирусам растений, включающим приготовление антигена путем размножения вирусов в ткани растения, гомогенизации зараженной ткани и ее осветления с последующей гиппериммуиизацией осветленным экстрактом лабораторных животных для получения сывороток. В качестве ткани, на которой размножают вирусы для приготовления антигенов,используют калл;юсную ткань растений. Способ состоит в следующем. От растений определенного вида, эараженньк соответствующим вирусом в период его максимального накопления изолируется каллюсная ткань. Рост инфицированной ткани поддер живается путем периодических пересевов (через каждые один - три месяца в зависимости от вида ткани) в течение длительного времени. Для приготовления антигена навеску каллюсной ткани, содержащей вирус, гомогенизируют в небольшом количестве О,1 М фосфатного буфера (рН 7,0) в густую кашицу, которая отжимается через два слоя марли. Экстракт осветляют низкоскоростным центрифугированием (15 мин при 3 000 об/мин). Супернатант - жидкость кремового цвета, используют в качестве антигена. Пример 1. Для получения высококачественных диагностических Содержание вирусов в культиви сывороток, специфичных к ХВК, ВМС, изолируют каллюсные ткани из рас-тений глютинозы (Nicotiana glutinosa L,),, либо дУрмана (Datura stramonium), зараженных ХВК, а также из растений сои, зараженной ВМС. Установлено, что указанные вирусы в высокой концентрации и продолжительное время способны сохраняться в каллюсных тканях (см. табл). Концёнтра1щю вирусов определяют методом индикаторов. Для ХВК таковым является гомфрена (Gophrena gloCosa) и марь белая (Chemopo iaceae album), для ВМС - растения сои. Раз введенные в культуру каллюсные ткани растений, зараженные Соответствующими вирусами, могут в течение года и более служить источником вируса и использоваться в качестве .антигена. .каллюсных тканях

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДМГНОСТИ- ЧЕСКИХ СЫВОРОТОК К ВИРУСАМ' РАСТЕНИЙ, включающий приготовление антигена путем размножения вирусов в ткани растения, гомогенизации зараженной ткани и ее осветления «г последующей гипериммунизацией осветленным экстрактом лабораторных животных для получения сывороток, отличающийся тем, что, с целью повышения специфичности сывороток в качестве ткани, на которой размножают вирусы, для приготовлек1-ш антигена используют каллюсную ткань растений.I

Осветленные низкоскоростным центрифугированием вытяжки из каллюсных тканей используются как ан- тигены.

Иммунизация проводится внутривенно возрастающими дозами через сутки. На восьмой день после завершения курса иммунизации берут пробу крови и определяют титр по капельной реакции на стекле. Таким способом были получены следующие сыворотки

3.К ВМС при использовании в качестве антигена выраженной каллюс/ Йной ткани сои с титром 1:64 после пяти инъекций. Наработка антигена при использовании субкультивируемой калдюсной ткани проста, экономична, размножение вируса в такой ткани надежно обеспечивает чистоту штамма на протяжении периода иммунизации. В этом случае налицо преиму6 щество каллюсной ткани перед живыми растениями, вьфащенными в теплицу, . Другое полезное свойство каллюсных тканей - отсутствие зеленого пигмента - хлорофилла, недостаточное освобождение от которого часто является одной из причин неспецифичности антивирусной сьшоротки, полученной при использовании интактных растений.