СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЦЕНТРАТОВ ВИРУСОВ, ВЫЗЫВАЮЩИХ ГЕМОРРАГИЧЕСКИЕ ЛИХОРАДКИ И ОБЛАДАЮЩИХ ИММУНОГЕННОЙ И ПРОТЕКТИВНОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 1995 года по МПК A61K39/12 

Изобретение относится к медицине, в частности к производству вирусных вакцинных препаратов.

Известен способ получения очищенных препаратов вируса Диареи крупного рогатого скота [1] . Вирус нарабатывали на монослойных культурах клеток в 490 см³ роллерных бутылях. Перед ультрафильтрацией для осаждения клеток и клеточных остатков использовали низкоскоростное центрифугирование, а затем культуральную вирусосодержащую жидкость концентрировали с объема 1 л до 60 мл ультрафильтрацией на мембранах HIP-100 (Amicon, США) с молекулярным весом проходимых частиц 100000. Ультрафильтрацию проводили при давлении 10 psi.

Однако описанный метод имеет ряд недостатков. Производительность установки при данных режимах невысока (1 л жидкости концентрируется в 15 раз за 1,5 ч. Тем не менее потери вируса достаточно велики и составляют 50% от исходного. Освобождение от неспецифического белка происходит всего в 2,2 раза. Кроме того, введен дополнительный этап очистки от клеточных остатков методом центрифугирования. Способ включает приготовление среды Игла МЕМ, заражение монослоя клеток Vero-Е6 в роллерных бутылях бляшечно-очищенным вирусом Марбург со множественностью инфекции 10^-1-10^-2 БОЕ/кл. После 30 мин адсорбции клетки инкубируют при 37^oC в минимальной среде Игла. Урожай вируса снимают через 5-7 дн. после заражения. Инфицированные клеточные культуры осветляют низкоскоростным центрифугированием 2000-3000 об/мин в течение 15 мин, вирус концентрируют полиэтиленгликолем, ресуспендируют в буфере и очищают с помощью изопикнического центрифугирования в последовательных градиентах тартрата К и сахарозы 18 ч при 30000 об/мин (ротор SW-40). Вирус растворяют в стерильном буфере и осаждают скоростным центрифугированием 50000 об/мин на роторе SW-50. Для приготовления вакцины вирус инактивируют γ-облучением или раствором формалина.

Целью изобретения является повышение производительности.

Указанная цель достигается тем, что способ включает приготовление питательной среды Игла МЕМ с человеческим сывороточным альбумином в количестве 0,04-0,06 мас.% и двойным набором аминокислот и витаминов, заражение вирусом монослоя культуры клеток и введение в него питательной среды. Далее вирус культивируют и собирают с монослоя клеток, после чего монослой клеток заливают свежей питательной средой и повторно культивируют вирус с последующим повторным его сбором. Вирус очищают от клеточных остатков с последующей его ультра- и диафильтрацией и инактивацией формалином или γ-излучением. Причем процесс ультрафильтрации осуществляют при разности давления на входе и выходе из ультрафильтрационного модуля не более 0,5 кг/см². Давление на входе в ультрафильтрационный модуль составляет 3,5 кг/см², а на выходе 3,0 кг/см².

Новыми по сравнению с прототипом являются следующие признаки способа. В питательную среду при ее приготовлении добавляют человеческий сывороточный альбумин в количестве 0,04-0,06 мас.% к объему этой среды. После сбора вируса с монослоя клеток последний заливают свежей питательной средой и повторно культивируют вирус с последующим повторным его сбором. Процесс ультрафильтрации осуществляют при разности давления на входе и выходе из ультрафильтрационного модуля не более 0,5 кг/см². Причем давление вирусной суспензии на входе в ультрафильтрационный модуль не превышает 3,5 кг/см², а на выходе - не более 3,0 кг/см².

Сравнение заявляемого способа с известными аналогами показывает, что отличительные от прототипа признаки проявляют новые неизвестные ранее свойства, состоящие в оптимальном подборе по вязкости и компонентному составу питательной среды на этапе культивирования, двукратном сборе ВКЖ с одного монослоя клеток и оптимизации процесса ультрафильтрации ВКЖ. В этой связи предлагаемое техническое решение соответствует критерию "изобретательский уровень".

На чертеже приведена схема осуществления предварительной очистки, концентрирования и диафильтрации на ультрафильтрационном модуле (УФМ).

Схема содержит следующие основные функциональные узлы: емкость 1 с исходной вирусосодержащей культуральной жидкостью (ВКЖ), емкость 2 с осветленной ВКЖ, емкость 3 с фильтратом, емкость 4 с жидкостью для диафильтрации, перистальтические насосы 5, манометры 6, модуль7 предварительной очистки, модуль 8 концентрирования и запорные клапаны 9. Приведенные функциональные узлы связаны между собой трубопроводами 10.

Пример выполнения способа получения иммуногенных препаратов, обладающих протективной активностью в отношении вируса Марбург, приведен в табл.1.

На первом этапе работы получают маточный вирус для заражения культуры клеток. Вирусом, прошедшим не более 5 пассажей на чувствительных животных, заражают монослой клеток фибробластов человека (линия Л-68) cо множественностью заражения 1:10. В качестве питательной среды используют среду Игла МЕМ с двойным набором аминокислот и витаминов с добавлением 0,04-0,06% ЧСА, 0,6% глутамина, 200 ед. /мл бензилпенициллина и 200 нг/мл cтрептомицина. После 72 ч культивирования при 37^oC ВКЖ cливают и при инфекционном титре для морских свинок не менее 10⁷ ЛД₅₀ используют для заражения культуры клеток. Маточный вирус может быть использован для наработки в течение 3 мес. при условии хранения не выше -8^oC без разморозки. Маточным вирусом заражают диплоидные клетки фибробластов человека Л-68. Исходные клетки Л-68 хранят в жидком азоте и выращивают путем серийных пересевов. В качестве ростовой среды используют раствор Игла МЕМ с 8-10% сывороткой крови плодов коровы. Культуру клеток выращивают в течение 3-4 cут. при посевной концентрации клеток (5-10) x10⁴ кл/мл среды и пересевают общепринятым способом. Для заражения маточным вирусом используют монослойную культуру клеток Л-68 пассажей 15-35, выращенную в 1 л матрасах. Ростовую среду из матрасов сливают, двукратно промывают монослой раствором Хенкса и заражают маточным вирусом с множественностью заражения 1:10. После инкубации при 20-25^oC в течение 30 мин вирус сливают, монослой 2 раза промывают поддерживающей средой и затем матрасы заливают 200 мл питательной среды Игла МЕМ с двойным набором амминокислот и витаминов с добавлением 0,04-0,06% ЧСА, 0,6% глутамина, 200 ед/мл бензилпенициллина и 200 нг/мл стрептомицина. Через 72 ч инкубации при 37^oC cобирают ВКЖ (вирусную культуральную жидкость) с титром не менее 10 ЛД₅₀ при титровании на морских свинках. Затем матрасы заливают 200 мл поддерживающей среды и инкубируют еще 48 ч при 37^oC. Культуральную жидкость собирают (титр не менее 10^6,8 ЛД₅₀). При необходимости ВКЖ может хранится не более 2 недель при 4^oC. Из первого и второго сливов делают объединенный вирусный сбор.

Префильтрация, концентрирование и очистка осуществляется в соответствии со схемой (см.чертеж). Освобождение клеточного детрита проводят путем фильтрования через фильтры МФА-С-0,6-1,5 (производство НПО "Полимерсинтез", г. Владимир). После фильтрования проводят концентрирование и очистку вируса на мембранах "Владипор" типа УАМ-100. Линейная скорость подачи ВКЖ на ячейку 1 л/мин. Давление на выходе должно быть не более 3 кг/см², давление на входе 3,5 кг/см², которое не должно превышать давление на выходе более, чем на 0,5 кг/см². Затем проводят диафильтрацию 10-кратным объемом раствора Хенкса. Конечный продукт представляет собой ВКЖ, сконцентрированную в 20 раз, освобожденную от низкомолекулярных соединений и клеточного детрита. Титр вируса в концентрате не менее 10⁸ ЛД₅₀ при титровании на морских свинках. Препарат инактивируют, добавляя формалин до конечной концентрации 0,1%.

Результаты определения реактогенных, физико-химических и протективных свойств препарата приведены в табл.1. Аттестация препарата методом Лоури показала, что содержание общего в нем белка составляет 2,3 ± 0,5 мг/мл. Содержание специфического вирусного белка, определенное в иммуноферментном методе, колебалось от 5,6 до 6,8 мкг/мл.

Эксперименты по проверке свойств проводились в соответствии с требованиями Минздрава СССР (РД-42-28-8-89). Определение протективных свойств проводилось на морских свинках ( 200- 250 г). Животные иммунизировались внутримышечно двукратно с интервалом 14 дн. Через 16 дн. после второй иммунизации опытным животным вводили внутрибрюшинно вирус Марбург в диапазоне доз 1-4 lg ЛД₅₀ в объеме 1 мл. Контрольных животных, которым по аналогичной схеме вводили физиологический раствор, заражали дозами вируса 0,1-3,0 lg ЛД₅₀. Учет результатов вели по гибели в течение 16 дн. Индекс резистентности, вычисляемый как разность lg ЛД₅₀в опыте и в контроле равнялся 2,7 ± 0,4. Отличия с контролем статистически достоверны (р < 0,01).

Препарат не обладает аллергезирующими и туморогенными свойствами, стерилен, апирогенен, не токсичен, рН препарата 7,2 ± 0,2.

Экспериментальные исследования показали, что предлагаемый способ может быть применен и для получения препаратов, обладающих протективной активностью в отношении вирусов Мачупо и Эбола. Технология культивирования вирусов Эбола и Мачупо, состав питательных сред и технология очистки и концентрирования ВКЖ такая же, как при получении препарата на основе вируса Маpбург.

В табл.2 приведена зависимость качественных характеристик препарата от исследуемых параметров на примере вируса Эбола, а в табл.3 - на примере вируса Мачупо. Анализ табл. 1-3 показывает, что предложенный способ позволяет за счет использования питательной среды с 0,04-0,06%-ным содержанием ЧСА снизить после всех операций содержание общего белка до 1,5 мг/мл при концентрирования вирусосодержащей культуральной жидкости (ВКЖ) в 20-30 раз. Пр использовании среды с большим, чем 0,06% содержанием ЧСА (повышается вязкость суспензии) идет забивка пор мембраны при ультрафильтрации, что существенно снижает производительность процесса. При более низком содержании (менее 0,04%) ЧСА снижается выход вируса при культивировании на монослое клеток. ЧСА также служит в препарате стабилизатором биологической активности. Кроме того, предложенный способ при двукратном сборе ВКЖ позволяет в два раза увеличить количество получаемого вируса. В процессе концентрирования и ультрафильтрации предлагается использовать оптимальное давление на выходе, равное 3 кг/см², а давление на входе - не более 3,5 кг/см². Предлагаемый режим обеспечивает максимальный выход вируса при достаточно хорошей очистке последнего от неспецифического белка. При режимах фильтрации, отличных от предлагаемого, происходит либо увеличение времени фильтрования, либо снижение выхода вируса за счет разрушения вируса на мембранах.

Технико-экономические преимущества предлагаемого способа состоят в следующем. По способу-аналогу [1] за 1,5 часа 1 л ВКЖ концентрируется в 15 раз, а потери специфического белка составляет 50% от исходного. Кроме того вследствие образования слоя высокомолекулярных белков в примембранном пространстве и необходимости проведения через каждые 10-30 мин очистки мембраны от этого слоя обратным током жидкости, производительность снижается в 5 раз и более. В предложенном способе при 20-кратной очистке ВКЖ потери специфического белка не превышают 10-15%, а 1 л материала концентрируется в 20 раз за 40 мин. Причем вследствие оптимизации компонентов и вязкости питательной среды и давления на входе и выходе из УФМ устраняется образование слоя высокомолекулярных белков в примембранном пространстве УФМ. Таким образом предлагаемый способ позволяет по сравнению с аналогом [1] повысить производительность в 2 и более раза при увеличении степени концентрирования ВКЖ в 1,4 раза и снизить потери специфического белка в 3-5 раз. По сравнению с прототипом [2] предлагаемый способ обеспечивает увеличение производительности.

Изобретение относится к медицине, а именно к вирусологии, и касается способа получения концентратов вирусов, вызывающих геморрагические лихорадки и обладающие иммуногенной и протективной активностью. Целью изобретения является возможность получать целевой продукт в препаративных и промышленных количествах. Сущность способа заключается в добавлении в среду культивации человеческого сывороточного альбумина в определенном количестве, смене среды с последующим повторным культивированием и сбором и концентрированием и очистке посредством ультрафильтрации на мембранах с размерами пор 80 - 100 нм. Технический результат заключается в возможности масштабирования процесса. 1 з.п. ф-лы, 1 ил., 3 табл.

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЦЕНТРАТОВ ВИРУСОВ, ВЫЗЫВАЮЩИХ ГЕМОРРАГИЧЕСКИЕ ЛИХОРАДКИ И ОБЛАДАЮЩИХ ИММУНОГЕННОЙ И ПРОТЕКТИВНОЙ АКТИВНОСТЬЮ, включающий приготовление питательной среды Игла - МЕМ с двойным набором аминокислот и витаминов, заражение вирусом монослоя культуры клеток, введение в него питательной среды, культивирование и сбор вируса с монослоя клеток, очистку вируса, его концентрирование с последующей инактивацией вируса формалином, отличающийся тем, что в питательную среду при ее приготовлении добавляют человеческий сывороточный альбумин в количестве 0,04 - 0,06% к объему этой среды, после сбора вируса с монослоя клеток последний заливают свежей питательной средой и повторно культивируют вирус с последующим повторным его сбором, а концентрирование и очистку осуществляют ультрафильтрацией на мембранах с размером пор 80-100 нм. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что процесс ультрафильтрации осуществляют при давлении вирусной суспензии на входе в ультрафильтрационный модуль, не превышающем 3,5 кг/см², а на выходе - не более 3,0 кг/см² при разности давлений на входе и выходе не более 0,5 кг/см².