Способ получения антигена вируса Марбург Советский патент 1993 года по МПК C12N7/00 A61K39/12 

Изобретение относится к вирусологии и может быть использовано при разработке и получении иммунобиологических препаратов на основе очищенных вирусных антигенов.

Целью изобретения является увеличение выхода вирусного антигена и снижение сроков его наработки.

Поставленная цель достигается тем, что морские свинки инфицируются дозой (0,5-2,0) 103 LDso, достаточной для возникновения заболевания: и выдерживаются в течение времени, достаточного для появления 10-20% погибших животных, с последующим проведением тотального забора крови у оставшихся животных. Далее из ви- руссодержащего материала выделяют и очищают вирусный антиген путем центрифугирования или центрифугирования и гель-хроматографии на макропористых стеклах.

По сравнению с прототипом новыми являются следующие признаки способа. Морские свинки инфицируются дозой (0,5-2.0) 103 LDso. выдерживаются в течение времени, достаточного для появления 10-20% погибших животных, а забор крови проводят тотально у оставшихся животных.

Сравнение данного способа получения препаративных количеств вируса Марбург с известными показывает, что отличительные от прототипа признаки проявляют новые, неизвестные ранее свойства, выявленные в процессе экспериментов, а именно: при ин- фицировании морских свинок указанной дозой имеет место максимальное накопление вируса в крови за 1-2 сут до гибели животного; для морских свинок, инфицированных дозой (0.5-2) 103 LDso, сроки инкубации сокращаются, 50%-ная гибель животных наблюдается на 7 сутки после заражения, что позволяет с большой точноел С

со

о

00 О

р

СА

стью прогнозировать сроки забора крови с максимальным содержанием в ней вируса; срок забора крови, определяемый наличием 10-20% падежа животных, соответствует периоду, когда наибольшее количество свинок (примерно 70%) имеют .максимальное содержание вируса в крови.

При этом электронно-микроскопическим исследованием было дополнительно показано, что физический титр вируса Марбург в крови морских свинок, н аработанного по данному способу, достигает величины порядка 10 °- 1011 вирионов на 1 мл при инфекционном титре 7,5-8,5 IgLDso, что на 3 порядка превышает концентрацию вирусных частиц при использо вании для наработки клеточных культур.

На фиг.1 приведена зависимость титра вируса Марбург в крови морских свинок от времени, предшествующего их гибели, и ин,-

фицирующей дозы, где: 1 - накопление вируса в крови при дозе заражения 104 LDso; 2 - то же, (1-2) 102 LDso: 3 - то же, (5-20) X LDso; на фиг.2 приведена динамика гибели морских свинок в зависимости от инфицирующей дозы (по результатам многолетних наблюдений при титровании вирусного материала на морских свинках), где: 1 - доза заражения 104 LDso: 2 - то же, (0,5-2) 103 LDso; 3 - то же, (0,5-2) 102 LDso; 4 - то же, (0,5-2) 101 LDso; на фиг.З приведена диаграмма по определению оптимальных сроков взятия крови у животных при дозе заражения (0,5-2) 103 LDso; на фиг.4 приведена микрофотография очищенного вируса Марбург.

В работе использовался вирус Марбург, полученный в Белорусском НИИ эпидемиологии и микробиологии МЗ СССР. Титрование вирусного материала осуществляли на морских свинках при внутрибрюшинном заражении, вычисление значений LDso проводилось по методу Кербера 8. Материал для инфицирования животных представлял собой 10% гомогенат печени морской свинки на растворе Эрла, предварительно оттитрованный и разведенный до концентрации, обеспечивающей получение необходимой дозы при заражении животного. Идентификация вируса Марбург в очищенных препаратах проводилась с помощью электронной микроскопии, электрофореза вирусных белков в ПААГ(поли- акриламидном геле) и в реакции ИФА.

Пример 1. Для наработки вирусного материала берут 40 морских свинок весом не менее 350-400 г, заражают внутрибрюшинно дозой 2 103 LDso на одно животное. Экспериментально установлено, что оптимальный срок тотального забора крови у свинок наступает при достижении их летальности 10-20% (5-6 сутки). Зависимость числа животных, имеющих

максимальный титр в крови от числа мявших животных (по диаграмме на фиг.З):

0

Процент животных, погибших в начальные сроки наблюдения

1-2

10

20

30

40

50

Процент животных.

имеющих при этом

максимальный титр

вируса в крови

30-35

70

68

60

53

44

15

0

0

5

0

5

0

5

5

Таким образом, при достижении летальности 10-20% (5-6 сутки), оставшихся животных забивают, тотально собирают кровь в сосуд, содержащий водный раствор гепари- на (250 ед. активности на 1 мл крови). Ко времени забора крови примерно у 70-80% оставшихся в живых свинок имеется максимальный титр вируса в крови (см. фиг. 3). Кровь центрифугируют в роторе JA-14 на установке J2-21 Beckman, США, при 2000 об/мин в течение 10 мин. Полученную плазму (порядка 100-150 мл) наслаивают на 30%-ный раствор сахарозы на STE-буфере (0,1 М NaCI; 0,001 М ЭДТА; 0,01 М трис-HCl: рН 7,5). Соотношение объемов плазмы и раствора сахарозы 3:1. Центрифугирование проводят на установке J2-21 в течение 4 ч при 4°С и 18000 об/мин с использованием 4-6 пробирокобъемом 40мл,Надосадочную жидкость удаляют, осадок из каждой пробирки ресуспендируют в гомогенизаторе Даунса в 5 мл STE-буфера, полученную суспензию центрифугируют в 20-60% градиенте сахарозы на роторе SW-40 в течение 8-10 ч при 45000 об/мин,

В ыход конечного продукта составляет порядка концентрацией белка до2мг/мл (по Лоури) с физическим титром до 3 10 вирионов/мл.

Пример 2. 50 морских свинок весом 200-300 г заражают дозой 5 102 LDso. При достижении летальности 20% животных забивают и тотально собирают кровь в сосуд с гепарином (250 ед. активности на 1 мл кро- .ви). В соответствии с диаграммой (фиг.З) на данный момент времени почти у 90% непогибших морских свинок имеется максимальный титр вируса в крови. Кровь центрифугируют на установке J2-21 при 2000 об/мин в течение 10 мин. Полученную плазму (80-120 мл) наслаивают на 30% раствор сахарозы на STE- буфере, центрифугируют на установке J2-21 втечение 4чпри4°Си 18000об/мин. Осадок из каждой пробирки гомогенизируют в 5 мл STE-буфера и полученную суспензию подвергают гель-фильтрации на колонке с МПС, модифицированными поливинилпир- ролидоном (марка СМП-1М -1000). Элюцию

при этом проводят фосфатным буфером с 0,15 М NaCI, pH 7,5, Выход конечного продукта составляет около 6-8 мг вирусного белка с концентрацией не ниже 0,1 мг/мл.

Пример 3. (Использование дозы заражения больше 2 103LDso).

40-50 морских свинок весом не менее 350-400 г заражают внутрибрюшинно дозой 10 LDso. При достижении летальности 10- 20% забор крови и выделение антигена проводят аналогично примеру 1. Выход антигена при этом примерно в 10-20 раз ниже, чем в примере 1, Меньшее накопление вируса в крови объясняется быстрым развитием болезни и поражением внутренних органов с последующей гибелью животных (см. фиг.1),

Л р и м е р 4. (Использование дозы .заражения меньшей 5 102 LDso).

50 морских свинок весом 200-300 г заражают дозой 102 LDso. При достижении летальности 20% забор крови и выделение антигена проводят в соответствии с примером 1. Выход антигена вируса Марбург примерно в 2 раза ниже, чем в примере 1. Это объясняется тем, что у половины оставшихся в живых морских свинок титр вируса в крови не достиг своего маскимального значения (см. фиг.2).

Технико-экономическая эффективность способа.

Преимущество данного способа можно показать на примере выделения 1 мг вирусного антигена по сравнению с прототипом и аналогом. При работе с особо опасными инфекциями затраты, связанные с эксплуатацией инженерных систем специальных лабораторных помещений повышенной безопасности, и на заработную плату персонала, в данном случае, многократно превышают стоимость используемых материалов,

Поэтому при сравнении принимались во внимание следующие параметры: сроки наработки вирусного материала, необходимого для получения 1 мг очищенного антигена, количество циклов наработки; время, необходимое на проведение операций по концентрированию и очистке.

Количество циклов определялось из условия одинакового числа занятых в работе людей при использовании одной центрифуги J2-21 на стадии концентрирования.

Временные затраты при этом приведены в таблице. Как видно из этой таблицы, предложенный способ обеспечивает меньшую (в 1,5 раза) продолжительность цикла получения вирусного антигена. Полученный с помощью заявляемого способа очищенный антиген наиболее целесообразно использовать для производства иммунобио- логических препаратов: диагностических систем, гипериммунных сывороток и т.п.

Увеличение выхода вирусного материала в предлагаемом способе обеспечивается за счет оптимизации дозы (0,5-2,0) 103 LDso инфицирования животных, при которой максимальное накопление вируса в крови достигается за 1-2 сут до гибели животного, а также за счет более точного определения момента забора крови животных, когда концентрация вируса в ней достигает максимального значения. По оценочным данным уровень наработки вируса в крови при появлении первых признаков заболевания примерно на один порядок ниже максимально достигаемого уровня (в предлагаемом способе) наработки вируса.

Формула изобретения

Способ получения антигена вируса Марбург, включающий инфицирование вирусом биологического объекта с последующим инкубированием, выделением и очисткой вируса, отличающийся тем, что из биологических объектов используют морских свинок, инфицирование проводят до- 0 зой 0,5-2,0 103 LDso, инкубируют до появления 10-20% погибших животных, а антиген выделяют из крови оставшихся в живых животных.

0

5

0

5

0

5

Использование: вирусология. Сущность изобретения: для получения антигена вируса Марбург морских свинок инфицируют дозой (0,5-2.0) 10 LD и выдерживают в течение времени, достаточного для появления 10-20% погибших животных, с последующим тотальным забором крови у оставшихся животных. Из вируссодержаще- го материала получают вирусный антиген путем центрифугирования. 1 ;збл., 4 ил.

Временные затраты на получение 1 мг антигена вируса Марбург

Инфицирование клеток и снятие урожая проводится с интервалом в 1 день.

Учитывается, что титр вируса в крови при появлении первых признаков заболевания может быть в 10 раз и более ниже максимально достижимого.

// {О

Время, предоествугаее гибели животных, сут.

Фиг-. Г

Продолжение таблицы

Средний титр вируса

в крови, fg

6

Не.1: л ч е с т р с погиб:::.; х

.ИГТТЧЬ Х, %

Срок наблюдения, сут.

Фиг. 2

ле & г

Время наблюдения, суп