Способ количественного определения ауксинов и цитокининов в растительном материале Советский патент 1992 года по МПК G01N30/06 

Изобретение относится к аналитической химии, в частности к количественному определению регуляторов роста растений в растительных экстрактах, и может быть использовано в химических, биохимических, физиологических исследованиях для определения в биологических объектах ауксинов и цитокининов.

Цель изобретения - повышение чувствительности, ускорение и упрощение определения.

Способ осуществляется следующим образом.

Свежий растительный материал фиксируют жидким азотом, растирают и добавляют меченые тритием аналоги. Пробу экстрагируют последовательно н-бутанолом и этанолом и концентрируют определяемые соединения путем пропускания пробы через патрон с амберлитом ХАД-4. Затем выделяют индивидуальные соединения на хроматографической колонке с обращенно- фазным сорбентом и определяют их молярную активность.

Количество фитогормона 8 исходном растительном материале рассчитывают по формуле:

(-Ј-)

VI

О

Јь

О

С

ел

где АО - молярная активность исходного Н- меченого фитогормона;

Ак - молярная активность выделенного фитогормона;

а - количество добавленного Н-мече- ного фитогормона;

х - количество эндогенного фитогормона. .

Количество индивидуального фитогормона, выделяемого на.стадии высокоэффективной хроматографии определяют по площади пика, используя УФ-детектор (длина волны 254 нм). Радиоактивность определяют с помощью жидкостного сцинтил- ляционного счетчика (эффективность регистрации трития около 30%).

Пример 1. Определение количества 6-бензиламинапурина (БАП) и кинетина в растительной ткани.

10 г свежей биомассы (листья, стебли 2-недельного растения) фиксировали жидким азотом, тщательно растирали, количественно переносили в колбу с помощью 80%-ного этанола и добавляли меченый тритием БАП (1,6 мКи. 17,7 Ки/ммоль) и кинетин (1,23 мКи, 8,97 Ки/ммоль). Объем довели до 100 мл 80%-ным этанолом и инкубировали при комнатной температуре в течение 4 ч на магнитной мешалке. Спирт слили, к биомассе добавили еще 100 мл 80%-ного этанола и оставил.и экстрагироваться на ночь. На следующий день объеди- нили спиртовые экстракты и центрифугировали при 5000 об/мин в течение 15 мин. Супернатант слили в колбу для выпаривания (потери меченого БАП составила 10%). Супернатант упаривали до половины исходного объема, центрифугировали при 5000 об/мин в течение 10 мин. Радиометрическая проверка показала, что потери Н-БАП нет. Добавили «3:1 н-бутанол (насыщенный водой.) и упарили досуха. Осадок растворили в 10 мл 95%-ного спирта (растворяется не весь осадок), перенесли в колбу, добавили 10 мл НаО и повторили упаривзние с бутанолом. Осадок растворили Е Б мл этанола (95%), перенесли в колбу и водой довели до 70%. Радиометрическая проверка показала,что потерь на этой стадии нет. С помощью NaOH довели рН до 8,0, экстрагировали два раза бутанолом в делительной воронке и собрали бутанольные фракции (потеря меченого БАП составила 1,0%). Бутанольную фракцию упарили досуха, растворили в 1 мл спирта (ОСЧ) и довели объем до 10 мл водой. Этот раствор пропустили через патрон 5x30 мм с амберлитом ХАД-4 (Sen/a), собрали водную фракцию, цитокинины смыли с патрона 10 мл 70% спирта (потери метки нет).

Спиртовой раствор упариги и к осадку добавили 5 мл 0,1 моль/л триэтиламмоний бикарбонат (ТЭАБ) в 40%-ном метаноле (рН 7,0, подвижная фаза). Пропустили этот рас- твор через патрон 5x30 мм с сорбентом лих- ропреп С-18 (ЧССР, 25-40 мкм). Собрали первую фракцию, смыли еще 5 мл подвижной фазы, объединили и упарили досуха, растворили в 50 мкл подвижной фазы (поте- риО,5%).

Выделение БАП и кинетина проводились на колонке 3,3x150 мм Separon sax С-18 7 мкм (ЧССР). Подвижная фаза 0,1 моль/л ТЭАБ рН 7.0 в 36%-ном метаноле, скорость 0,5 мл/мин, УФ-детектор, А 254нм. Время удерживания БАП 31 мин, кинетина - 14,3 мин.

Пики, соответствующие БАП и кинетину, собрали, измерили молярную активность,

которая оказалась равной 8,15 Ки/моль в

первом случае и 2,18 Ки/моль во втором

случае. ,

Содержание эндогенного БАП и кинетина в исходном растении рассчитывали по приведенной выше формуле.

Результаты определения количества БАП и кинетина приведены в табл. 1.

Пример 2. Определение количества

индолил-3-уксусной кислоты (ИУК).

10 г свежего растительного материала фиксировали жидким азотом и тщательно растирали. Хорошо размельченный порошок перенесли в колбу, добавили 3Н-ИУК

(0,33 мКи, 6,5 Ки/ммоль), 100 мл метанола и поместили на магнитную мешалку при 0°С на ночь в темноте. Затем гомогенат центрифугировали при 10000 об/мин в течение 15 мин . Супернатант слили в колбу для упаривания (потеря меченого ИУК на этой стадии составила 9,5%) и упарили досуха. Осадок растворили в 70%-ном метаноле, перенесли в колбу, упарили до водной фазы, рН довел и 1 н HCI до 3,0 и центрифугировали (потери

ИУК меченого 2,0%). Затем супернзтант пропустили через патрон с амберлитом ХАД-4 (серва) 5x30 мм. Ауксины с патрона смывали 70%-ным метанолом (потеря 1,0%). Экстракт упарили досуха, осадок растворили в подвижной фазе (0,1 моль/л ТЭАБ. рН 7,0 в 40%-ном метаноле), пропустили через патрон с лихропрелом С-18. С патрона смывали 5 мл той же подвижной фазы (потери Н-ИУК нет). Затем собранные фракции упарили досуха и растворили в 50 мкл подвижной фазы.

Выделение ИУК проводили на колонке Separon sax С-18, 7 мкм (ЧССР). Подвижная фаза 0,1 моль/л ТЭАБ, рН 7,0 с 7% ацето- нитрила, скорость 0.5 мл/мин, УФ-детектор, Я 254 нм. Время удерживания ИУК - 21,4 мин. Пик, соответствующий ИУК, собрали и определили его молярную активность.

Результаты определения количества ИУК в описанном и другом объектах приведены в табл. 2.

Предлагаемый способ позволяет существенно сократить время анализа до суток (почти в 5 раз) за счет сокращения числа стадий хроматографической очистки пробы, упростить и удешевить процесс определения фитогормонов за счет применения менее дефицитных и более дешевых тритиевых аналогов взамен 14С-аналогов.

Способ позволяет работать на первой стадии с малым количеством биомассы, что обуславливает большую чувствительность предлагаемого способа. Увеличение чувствительности связано с значительным сокращением потерь исследуемого материала на всех стадиях процесса и сокращением числа этих стадий. Последнее особенно важно при работе в лабораторных условиях со стерильными растениями, количество биомассы которых ограничено.

Формула изобретения

1. Способ количественного определения ауксинов и цитокининов в растительном материале путем добавления к гомогенату

меченых аналогов, экстракции органическим растворителем, предварительной подготовки пробы, хроматографического выделения индивидуальных соединений на хроматографической колонке с обращеннофазным сорбентом и последующим определением их молярной активности, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности, ускорения и упрощения определения, добавление в гомогенат меченых аналогов осуществляют до стадии экстракции, а предварительную подготовку пробы проводят последовательной трехкратной экстракцией н-бутанолом и этано- лом с концентрирова нием определяемых

соединений.

2. Способ по п. 1.отличающийся

тем, что концентрирование определяемых

соединений осуществляют пропусканием

пробы через патрон с амберлитом ХАД-4 и

с обращенно-фазовым сорбентом.

Изобретение относится к аналитической химии, в частности к количественному определению регуляторов роста растений в растительных экстрактах, и может использоваться в химических, биохимических, физиологических исследованиях для определения в биологических объектах ауксинов и цитокининов. Целью изобретения является повышение точности и ускорение опреде- - ления. Свежий растительный материал фиксируют жидким азотом, растирают и добавляют меченые тритием аналоги. Пробу экстрагируют последовательно н-бутано- лом и этанолом и концентрируют определяемые соединения Путем пропусканий через патрон с амберлито м ХАД-4. Затем выделяют индивидуальные соединения на хроматографической колонке с обращенно- фазным сорбентом и определяют их мо - лярную активность. 1 з.п. ф-лы. 2 табл. fe

Таблица 1

Таблица 2