СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФИТОГОРМОНОВ В РАСТИТЕЛЬНОМ МАТЕРИАЛЕ Российский патент 1997 года по МПК G01N30/06 

Изобретение относится к аналитической химии, в частности к количественному определению фитогормонов в растительном материале, и может быть использовано в химических, биохимических, физиологических исследованиях.

Известны способы количественного определения регуляторов роста растений, которые включают в себя гомогенизацию растительного материала, экстракцию его водно-спиртовыми смесями и выделение из экстракта на конечной стадии индивидуальных соединений с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Количество индивидуальных фитогормонов определяют по площади пика или спектрофотометрически [1-3] либо по изотопному разведению меченого соединения, добавленного после стадии экстракции [4] или до стадии экстракции [5] эндогенным фитогормоном, содержащимся в растении.

Однако известные способы ограничены определением ауксинов [4] или ауксинов и цитокининов [5] Это не позволяет определить весь гормональный статус растения, включающий главным образом ауксины, цитокины и гиббереллины.

Известен способ количественного определения ауксинов и цитокининов в растительном материале, заключающийся в гомогенизации материала, добавлении к гомогенату меченых тритием ауксинов и цитокининов, экстракции органическим растворителем предварительной пробы, хроматографической очистке с применением Амберлита ХАД-4 и Лихропрена С-18 и выделении индивидуальных соединений с помощью ВЭЖХ (авт. св. СССР N 1704065, G 01 N 30/06, 1989).

Недостатком данного способа является то, что в растительном материале не определяется важный класс гормонов роста растений гиббереллины. Для исследований по физиологии растений важно одновременное определение в растительных экстрактах всех основных классов гормонов растений, а именно: ауксинов, цитокининов и гиббереллинов. При этом существенно, чтобы это определение осуществлялось в едином технологическом процессе.

Кроме того, для количественного определения фитогормонов известным способом требуется относительно большое количество растительного материала (около 10 г), что не позволяет вести определение при ограниченном количестве исследуемого растительного материала.

Целью изобретения является возможность использования для определения малых количеств исследуемого растительного материала (около 1-3 г), что особенно важно при работе с трансгенными растениями или при раздельном определении фитогормонов в различных частях одного и того же растения. Кроме того, при реализации изобретения становится возможным одновременное определение в одной растительной пробе трех классов фитогормонов: цитокининов, ауксинов и гиббереллинов. Чувствительность определения повышается, процесс очистки экстракта ускоряется.

В способе количественного определения фитогормонов в растительном материале, включающем его гомогенизацию, добавление к гомогенату меченых аналогов определяемых фитогормонов, экстракцию из гомогената фитогормонов низшим спиртом, удаление из экстракта балластных веществ, концентрирование фитогормонов в очищенном экстракте последовательным его пропусканием через Амберлит ХАД-4 и затем через Лихропрен С-18 с использованием УФ-регистрации, хроматографическое выделение индивидуальных фитогормонов путем пропускания очищенного и сконцентрированного экстракта через обращенно-фазовый сорбент, определение молярной активности выделенных индивидуальных фитогормонов и расчет их содержания в исходном материале, выполнение удаления балластных веществ из экстракта путем его многократного последовательного упаривания и растворения образующихся при этом осадков в уменьшающихся объемах низшего спирта с отбрасыванием нерастворяющихся в спирте компонентов осадков и проведение УФ-регистрации при 214 нм, позволяют ускорить процесс очистки экстракта, повысить чистоту очищенного сконцентрированного экстракта, повысить чувствительность УФ-регистрации и тем самым снизить количество растительного материала, необходимое для проведения определения, а использование в качестве меченых аналогов меченных тритием ауксинов, цитокининов и гиббереллинов позволяет одновременно определять в растительном материале содержание трех классов фитогормонов.

Было установлено, что многократное последовательное упаривание спиртового экстракта и растворение образующихся при этом осадков в уменьшающихся объемах низшего спирта с отбpасыванием нерастворяющихся в спирте компонентов осадков позволяет повысить степень очистки экстракта и ускорить процесс очистки. УФ-регистрация очищенного сконцентрированного экстракта при 214 нм повышает чувствительность процесса регистрации, а поэтому для получения экстракта становится возможным уменьшить количество растительного материала, необходимое для выполнения определения. К тому же гиббереллины определяются только при 214 нм и не определяются при 260 нм (по прототипу).

Пример.

Объекты исследования: индолил-3-уксусная кислота (ИУК), зеатин (Зеа), зеатинрибозид (Зео), гиббереллин А1 (ГАI).

1-3 г свежей биомассы листья, стебли томата (7 линий) фиксировали жидким азотом, тщательно растирали, количественно переносили в колбу с помощью 80% -ного метанола (этанола) и добавляли меченные тритием фитогормоны (ауксины, цитокинины, гиббереллины). Объем довели до 100 мл 80% -ным метанолом (этанолом) и оставили экстрагироваться на ночь на магнитной мешалке при температуре 5-10^oС.

На следующий день центрифугировали экстракт при 6000 об/мин 20 мин. Супернатант сливали в колбу для упаривания, упаривали до половины исходного объема и центрифугировали еще раз при 6000 об/мин 10 мин (потеря метки 10%). Супернатант упаривали досуха. Осадок растворяли в 10 мл 95%-ного этанола (растворяется не весь осадок). Раствор переносили в колбу и еще раз упаривали досуха. Осадок повторно растворяли в 5 мл 95%-ного этанола (растворяется также не весь осадок). Раствор заново переносили в колбу и упаривали досуха. Осадок вновь растворяли в 500 мкл 95%-ного этанола. Если растворился не весь осадок, то стадии упаривания и растворения (в 500 мкл спирта) повторяли до тех пор, пока не растворился весь осадок. Таким образом максимально возможно на данном этапе избавлялись от водорастворимых веществ, содержащихся в растительном экстракте.

Полученный раствор упаривали досуха, растворяли в 300-500 мкл 10%-ного этанола и наносили на патрон 10х40 мм с Амберлитом ХАД-4 (Serva), cмывали оставшиеся водорастворимые вещества водой (10 мл), а цитокинины, ауксины и гиббереллины 70%-ным этанолом (10 мл) (потери метки нет). Спиртовую фракцию упаривали, к осадку добавляли 5 мл 35%-ного метанола в 0,1%-ной трифторуксусной кислоте (ТФУ) (рН 6,0, подвижная фаза). Пропускали этот раствор через патрон с сорбентом Лихропрен С-18 (ЧСФР, 25-40 мкм). Собирали первую фракцию, смывали еще 5 мл подвижной фазы, фракции объединяли, упаривали досуха, растворяли в 200 мкл подвижной фазы (потеря метки 0,5%).

Выделение целевых продуктов осуществляли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на колонке 4,6 мм х 25 см, Zorbax ODS. Подвижная фаза 35%-ный метанол в 0,1%-ной ТФУ (рН 6,0), скорость 1 мл/мин, УФ-детектор, 214 нм. Время удерживания: ИУК 7,3 мин; Зеа 10 мин; Зео - 13,5 мин; ГАI 2,7 мин. Пики, соответствующие ИУК, Зеа, Зео, ГАI, собирали, измеряли удельную активность. Содержание эндогенных ауксинов, цитокининов и гиббереллинов в исходном растении рассчитывали по формуле:

где A_o молярная активность исходного ³H-меченого фитогормона (мКu/мкм);
A_к молярная активность выделенного фитогормона, (мКu/мкм);
a количество добавленного ³H-меченого фитогормона (мкм);
Х количество эндогенного фитогормона (мкм).

При необходимости проводили рехроматографию целевых продуктов методом ВЭЖХ на колонке 4,6 мм х 25 см Zorbax ODS. Подвижная фаза 25%-ный метанол в 0,1 М триэтиламинобикарбонате. Времена удерживания: для ИУК 12 мин; Зеа 19,4 мин; Зео 28,2 мин; ГАI 24,8 мин.

Время, необходимое для определения (для одного анализа) новым способом - 8-10 ч, известным (прототип) 20-22 ч.

Результаты количественного определения ИУК, Зеа, Зео и ГАI приведены в таблице.

Таким образом, новый способ позволяет расширить спектр определения фитогормонов за счет гиббереллинов, увеличить чувствительность определения практически на порядок за счет применения на стадии ВЭЖХ УФ-детектора с регистрацией при 214 нм, упростить и ускорить пpоцесс за счет сокращения стадии обработки и экстракции н-бутанолом. Способ позволяет работать с минимальным количеством биомассы, что также обуславливает большую чувствительность определяемого способа. Принципиальным является тот факт, что новый способ дает возможность определять гормональный статус в различных частях растения, например в корнях, стеблях и листьях одного и того же растения. Это важно при работе в лабораторных условиях со стерильными растениями, особенно на начальных стадиях.

Использование: для количественного определения фитогормонов в растительном материале. Сущность изобретения: способ включает гомогенизацию растительного материала, экстракцию смеси фитогормонов из полученного гомогената, очистку полученного экстракта, разделение компонентов очищенного экстракта методом ВЭ ЖХС с использованием обращенно-фазового сорбента, подвижной фазы и контроля за процессом разделения на фракции по наличию УФ-поглощения, определения содержания индивидуальных фитогормонов в полученных фракциях и расчет их содержания в растительном материале по полученной величине. В качестве обращенно-фазового сорбента используют Zorbax ОДS, в качестве подвижной фазы 0,35%-ный раствор метанола в 0,1%-ном растворе трехлоруксусной кислоты, рН которого 6,0. Контроль за процессом разделения осуществляют при λ=214 нм. 2 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Способ определения содержания фитогормонов в растительном материале, включающий его гомогенизацию, экстракцию смеси фитогормонов из полученного гомогената, очистку полученного экстракта, разделение компонентов очищенного экстракта методом ВЭЖХ с использованием обращенно-фазового сорбента, подвижной фазы и контроля за процессом разделения на фракции по наличию УФ поглощения, определение содержания индивидуальных фитогормонов в полученных фракциях и расчет их содержания в растительном материале по полученной величине, отличающийся тем, что в качестве обращенно-фазового сорбента используют Zorbax ODS, в качестве подвижной фазы имеющий рН 6,0 35%-ный раствор метанола в 0,1%-ном растворе трихлоруксусной кислоты, а контроль за процессом разделения осуществляют при λ = 214 нм.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в гомогенат добавляют меченые аналоги фитогормонов, а в полученных фракциях, содержащих индивидуальные фитогормоны, определяют их молярную активность, с использованием которой рассчитывают содержание индивидуальных фитогормонов в исходном материале. 3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что в качестве меченых аналогов фитогормонов используют меченные тритием ауксины, цитокинины и гибберемины.