Настоящее изобретение относится к способу получения новых веществ, имеющих большое значение в качестве биологически активных веществ (либо функционального, либо структурного типа), в частности, производного гликопротеина или его функционального производного, которое представляет собой молекулу межклеточной адгезии (обозначаемого в дальнейшем JCAM-2).
Молекулы межклеточной адгезии участвуют в процессе, в соответствии с которым происходит распознавание популяций лимфоцитов и адгезии к клеточным субстратам таким образом, что они могут мигрировать к центрам раздражения и взаимодействовать с клетками в процессе реакции раздражения. Для этого, чтобы они могли действовать, необходимо наличие указанных рецепторов - молекул межклеточной адгезии на поверхности клеток лимфоцитов. Указанные рецепторы обладают способностью осуществлять адгезию лимфоцитов к
другим лейкоцитам или к эндотелиальным и прочим клетками несосудистого характера.. Молекулы межклеточной адгезии представляют собой лиганд природного типа, связанный с молекулами рецептора, например, молекулами семейства гетеродимера ЛФА- 1 (связанный с лимфоцитарной функцией антиген-1).
Способ получения молекул рекомбинан- тной ДНК, кодирующей JCAM-2, состоит в получении библиотеки, кодирующей ДНК JCAM-2, с использованием плазмидного вектора CDM8. Полученную библиотеку используют для трансфакции клеток COS. которые обычно не экспрессируют JCAM-2. Трансфецированные клетки вводят в контакт с пластинками, покрытыми связанным с лимфоцитарной функцией антигеном 1 (ЛФА-1) в присутствии антитела типа анти- JCAM-1, клетки, адгезированные на ЛФА-1, удаляют и культивируют, после чего выделяют плазмиду pCDJC 2.27.
со
О
ю
00
со VI
со
Указанную плазмиду используют для продуцирования JCAM-2 или его функционального производного, или его части согласно любому известному способу, JCAM-2, его функциональное производное или его часть предпочтительно используют в качестве противовоспалительных средств, Функциональные производные JCAM-2 представляют собой соединения, обладающие биологической активностью (функциональной или структурной), практически аналогичной биологической активности J САМ-2.
П р и м е р 1, Клонирование ДНК, кодирующей JCAM-2.
ЛФА-1 получают очисткой из лизата SKW-3 с использованием метода- иммуно- аффинной хроматографии на сефарозе TS- 2/4-ЛФА-1 моноклональное антитело, элюирование осуществляют при рН-11,5 в присутствии 2 мМ хлористого магния и 1% октилглюкозида. Л ФА- 1 (10мкг/200мкл/6 см пластинку) наносят на бактериологические чашки Петри посредством разбавления октилглюкозида до 0,1% в фосфатно-солевом буферном растворе с 2 мМ хлористого магния и инкубирования при 4°С в течение ночи. Пластинки блокируют посредством 1% бычьего сывороточного альбумина и хранят в смеси фосфатного буфера (2 мМ хлористого магния, 0,2% бычьего сывороточного альбумина, 0,025% азида, 50 мкг/мл гентамицина),
Синтез библиотеки, кодирующей ДНК из стимулированных липополисахаридами эндотелиальных клеток пупочной вены, осуществляют, в соответствии с известными методиками. После синтеза второй спирали кодирующую ДН К связывают с Bst Х1-адап- торами и выделяют ДНК, содержащую более 600 пар оснований с использованием метода электрофореза на агаровом геле при низкой температуре плавления, Затем ДНК связывают с CDM8, вводят в используемый в качестве хозяина Е. СоМ МС-1061/РЗ и наносят на пластинки, получая 5 х 10 колоний. Колонии переводят в суспензию в LB среде, объединяют и получают плазмиду с использованием обычного метода щелочного растворения (лизиса). Пластинки с клетками COS подвергают трансфекции плазмидной ДНК с использованием смеси ДЭАЭ-декстрана. JCAM-2 является рези- стентным по отношению к трипсину на эндотелиальных клетках и клетках SKW-3. Клетки COS спустя 3 суток после трансфекции суспендируют посредством обработки 0,025% трипсина, 1 мМ ЭДТА, HBSS и помещают на покрытые ЛФА-1 пластинки в соответствии с известным методом меченых
51Сг клеток COS. Адгезированные клетки высвобождают посредством доведения концентрации ЭДТА до 10 мМ.
Плазмиду выделяют из адгезированных
популяций клеток COS с использованием среды Хирта. Полученной плазмидой трансформируют штамм Е. coll МС-1061 /РЗ. колонии на пластинках суспендируют в LB-среде, объединяют и выделяют плазмиду посредством щелочного лизиса. Селекцию связывающихся с ЛФА-1 трансфецированных клеток COS и выделе- ние плазмиды повторяют в ходе еще двух циклов. Объединенные колонии, получен5 ные после третьего цикла, выращивают до насыщения в 100 мл среды с 18 мкг/мл тетрациклина и 20 мкг/мл ампициллина. Плазмиду получают, фракционируют путем гельуэлектрофореза с 1 %-ной LMP-a га розой
0 и трансформируют в штамм МС-1061 /РЗ отдельно каждую плазмиду из 9 фракций различного размера. Индивидуальные плазмиды из фракции с наибольшей активностью в отношении адгезии клеток COS к
5 ЛФА-1 исследуют на предмет размера вставки путем расщепления ХЬа1 и тестируют на адгезионную способность. В результате получают плазмиду со вставкой, кодирующей ДН К J САМ-2 размером 1,1 тыс.
0 оснований (pCDJC 2.27),
Плазмиду JСАМ-2 типа pCDJC 2.27 или конструкцию JCAM-1, содержащую фрагмент Sal1-Kpn1 размером 1,8 тыс. оснований в СОМ 8 (2 мгк/10 см пластинку) вводят
5 в клетки COS, используя смесь ДЭАЭ-Де- кстран. Клетки COS суспендируют в смеси 0,025% трипсина, 1 мМ ЭДТА через 3-ое суток после трансфекции и метят Сг, Примерно 2 х 10 клеток COS, меченых 51Сг в 2
0 мл фосфатного буфера, содержащего 5% сыворотки плода коровы, 2 мМ хлористого магния, 0,025% азида (буфер) с 5 мкг/мл моноклинальных антител, инкубируют на покрытых ЛФА-1 пластинках размером б см
5 в течение 1 часа при 25°С. Несвязавшиеся клетки удаляют посредством осторожного покачивания и траекторной промывки буфером. Связавшиеся клетки элюируют, добавляя ЭДТА до концентрации 10 мМ, и
0 определяют радиоактивность.
JCAM-1 экспресс и рую т 25% трансфецированных клеток COS. После промывки несвязанные клетки обеднены клетками J CAM-1+, тогда как адгезированные клетки,
5 высвобождаемые из покрытого ЛФА-1 пластика, практически полностью представляют собой разновидность J CAM-1+, Адгезия клеток JCAM-1 + к покрытому ЛФА-1 пластику ингибируется моноклональными антите- лами RR 1-1 JCAM-1. Покрытые ЛФА-1 слои
чашек Петри стабильны после более чем 5 циклов адгезий клеток COS и их элюировэ- ния посредством ЭДТА, пластинки хранят до использования при 4°С в присутствии ионов Мд2+.
Для клонирования JCAM-2 получают из эндотелиальных клеток библиотеку плаз- мидного вектора СОМ 8, она демонстрирует наличие как зависимых от JCAM-1, так и независимых от JCAM-1 компонентов адге- зии, зависящей от ЛФА-1.Трансфецирован- ные клетки COS инкубируют в покрытых Л ФА-1 чашках Петри при наличии монокло- нальных антител JCAM-1 для предотвращения выделения кодирующей ДНК JCAM-1. Адгезированные клетки элюируют ЭДТА, а плазмиды выделяют и амплифицируют. После трех циклов трансфекции, адгезии, выделения плазмиды и фракционирования по размерам, 30 плазмид анализируют с ис- пользованием рестрикционной эндонуклеа- зы. Из трех плазмид со вставкой более 1,0 тыс. пар оснований (т.п.о.) одна, введенная в клетки COS посредством трансфекции, обуславливает адгезию по отношению к Л ФА-1.
П р и м е р 2. Характеристика последовательности, кодирующей ДНК JCAM-2,
Последовательность кодирующей ДНК JCAM-2 размером 1052 пар оснований (п.о.) содержит нетранслированные зоны 5 (62 пары оснований) и 3 (167 пар оснований). Сигнал полиэденилирования ААТАСА в положении 1019 продолжается в положении 1058 пар оснований поли(А)-концом. Самая длинная зона открытой рамки считывания начинается с первой последовательности АТС в положении 63 и заканчивается последовательностью крдона терминации TAG в положении 885.
Последовательность содержит от 1-й аминокислоты до 201-й внеклеточный домен, за которым следует 26 остатков, составляющих гидрофобный трансмембранный домен, и 26 остатков, составляющих циклоплазматический домен. Альфа-спиральный трансмембранный сегмент содержит остатки треонина и серина, остающиеся по одну сторону, что позволяет предполагать возможность самоассоциа- ции или ассоциации с другими мембранными белками в плоскости мембраны, Цитоплазматический домен носит основной характер, в среднем гидрофобного характера. Масса зрелого полипептида равна 28 176 дальтонов, что, в случае, если используется N-связанных. сайтов гликозелирова- ния, должно привести к гликопротеину JCAM-2 массой примерно 46 килодальто- нов.
П р и м е р 3. Анализ гибридизации ДНК и РНК.
Для блотинга используют 6 мкг (поли (А)+РНК, которую денатурируют, подвергают электрофорезу в 1 %-ном агарозном геле с формальдегидом, переносят на нейлоновую мембрану. Полнота переноса подтверждается просвечиванием геля УФ-излучением и флуоресцентным фотографированием блота.
Геномные ДНК гидролизуют с пятикратными по сравнению с рекомендациями изготовителя количествами эндонуклеаз EcoR1 и Hlndlll. После электрофореза в 0,8%-ном агарозном геле ДНК анализируют, Блоты РНК и ДНК предгибридизируют и гибридизируют в соответствии со стандартными методиками, используя кодирующие ДНК JCAM-2 или JCAM-1, меченые pp/dXTP.
ДНК, кодирующая JСАМ-2 размером 1.1 т,п.о, гибридизируется с поли (А) мРНК размером 1,4 т.о. и слабо- с мРНК размером 3 тыс. оснований, в отличие от мРНК JCAM-1 размером 3,3 и 2,4 тыс. оснований. мРНК JCAM-1 четко индуцируется в эндотелиальных клетках липополисахаридами. Напротив, мРНК JCAM-2 дает сильную базальную экспрессию в эндотелиальных клетках и более не индуцируется липополисахаридами.
мРНК JСАМ-2 содержится в широком круге разновидностей клеток, включая линии клеток лимфобластоидов Рамос и BBNB, моноцитов U-937, и лимфобластоидов SKW3 о чем свидетельствует средняя или.большая продолжительность выдержки на автодиаграмме. Из числа перечисленных выше видов клеток SKW3, U-937 и BBNB проявляют зависимую от Л ФА-1, независимую от JCAM-1 адгезию к клеткам ЛФА-1+, и к пластине, покрытой Л ФА-1. Линия клеток эпителия Hela, которая проявляет только наличие зависимого от JCAM-1 компонента адгезии, не обнаруживает MPHKJCAM-2 даже после продолжительной экспозиции авторадиограммы. Распределение клеток J САМ-2 таким образом соответствует независимому от JCAM-1 компоненту адгезии.
Блоттинггеномной ДНК, гибридизован- нойс ДНК, кодирующей J САМ-2, обнаружи- вает единственный доминантный фрагмент EcoR I размером 8,2 т.п.о. и фрагмент Hind 111 размером 14 т.п.о., предполагая наличие единичного гена с большей частью кодовой информации в пределах 8 т.п.о.
П р и м е р 4. Сравнение последовательностей аминокислот JCAM-1 и J САМ-2.
Вследствие их функциональной близости как лигандов ЛФА-1. последовательности аминокислот JCAM-1 и JCAM-2 имеют более общие черты. JCAM-1 является членом семейства иммуноглобулина, и его внеклеточный домен полностью состоит из пяти С-аналогичных доменов. Внеклеточный домен JCAM-2 из 201 аминокислоты состоит из двух иммуноглобулиновых С-аналогичных доменов с предполагаемыми связанными дисул ьфидными связями цистеинами, отстоящими на 43 и 56 остатков, и с предсказанной структурой бета-спи- рали. Два иммунослобулиноподобных домена JCAM-2 идентичны на 34% в отношении последовательностей аминокислот с двумя наиболее N-терминальными доменами JCAM-1 при определенном по программе ALIGN среднеквадратичном отклонении от среднего, равном 15, и на 27% идентичны доменам 3 и 4 JCAM-1 при определенном по программе ALIGN среднеквадратичном, отклонении от среднего значения, равном 3.
Поиск с использованием запрограммированных без данных выявляет лишь частичную гомологию доменов с прочими членами семейства иммуноглобулинов. LCAM-2 на 17% и 19% идентичен двум N- терминальным доменам молекул адгезии JCAM соответственно, тогда как в случае JCAM-1 идентичность составляет соответственно 19% и 20%.
JCAM-2 определяют с использованием селекции функциональной кодирующей ДНК, которая не требует предварительной идентификации белков посредством биохимических или иммунологических методик.
Выделение ДНК, кодирующей JCAM-2, подтверждает существование альтернативного лиганда Л ФА-1. Распределение мРНК в случае JCAM-2 на ограниченном количестве клеток, которые характеризуются как зависимые по JCAM-1 и независимые по JCAM-1 в отношении Л ФА-1 адгезии, предполагает, что JCAM-2 соответствует всем наблюдаемым случаям независимой по JCAM-1 и зависимой по Л ФА-1 адгезии.
Установлено, что JCAM-1 является рецептором для большой группы риновирусов, которые вызывают 50% обычных простуд. JCAM-2 может также функционировать в качестве рецептора риновирусов или других пиконавирусов. Таким образом его
можно использовать в терапевтических целях для подавления инфекции, вызываемой указанными вирусами.
Семейство лигандов ЛФА-1 подчеркивает важность этого направления распознавания, которое может служить механизмом для сообщения высокой специфичности и функциональных различий. На экспрессию JCAM-2 не влияет цитокинез на клетках. Трансфецированные JCAM-2 клетки COS
свободно отходят от покрытого ЛФА-1 пластика, Это может быть обусловлено малыми размером JCAM-2, что делает его менее доступным для ЛФА-1 на искусственном субстрате, или различиями в последовательностй, которые могут вести к различиям в аффинности.
Отчетливые цитоплазменные домены JCAM-1 и JCAM-2 могут передавать различные сигналы или могут вызывать различную
локализацию на поверхности клетки, аналогичным образом, сигнализация или взаимодействие с цитоскелетом посредством ЛФА-1, могут различаться в зависимости от того, связывается ли JCAM-1 или JCAM-2.
Таким образом, JCAM-1 и второй контррецептор ЛФА-1, JCAM-2 представляют собой подсемейство иммуноглобулина (1д).
35
Формула изобретения
Способ, получения рекомбинантной плазмидной ДНК pCDJC 2.27, кодирующей гликопротеин межклеточной адгезии, заключающийся в том, что из стимулированных эндотелиальных клеток пупочной вены выделяют ДНК, клонируют ее в векторе CDM8, трансфецируют в клетки COS, отбирают их на пластинках, покрытых антителом с лимфоцитарной функцией в присутствии
анти-иСАМ-1-антитела, из отобранных клеток выделяют целевую плазмиду pCDJC 2.27.
Использование: получение гликопроте- ина межклеточной адгезии (JCAM-2). Сущность изобретения: из стимулированных эндотелиальных клеток пупочной вены выделяют ДНК, клонируют ее в векторе CDM8, трансфецируют в клетки COS, клетки отбирают на пластинках, покрытых антителом с лимфоцитарной функцией в присутствии JCAM-1-антитела, из отобранных клеток выделяют целевую плазмиду pCDIC 2.27.
