Способ экспрессии митогенного белка эндотелиальных клеток человека в ЕSснеRIснIа coLI Советский патент 1993 года по МПК C12N15/24 C12N15/74 

Изобретение относится к генетической инженерии, в частности к синтезу митоген- ного эндотелиального белка методом ре- комбинантных ДНК.

Фактор роста эндотелиальных клеток (ФРЭК) является митогеном эндотелиальных клеток in vitro.

ФРЭК выделяют путем осаждения суль- фатом стрептомицина, гель - проникающей хроматографией, осаждения сульфатом аммония и аффинной хроматографией на гепа- рин-сефарозе.

Выделены многочисленные формы бычьего ФРЭК путем элюирования его линейным градиентом натрийхлорида из колонки на гепарин-сефарозе или обра- щенно-фазовой высокожидкостной хроматографией (ВЖХ). Два выделенных полипептида, обозначенные альфа- и бета- ФРЭК, имеют мол.м. 17000 и 20000. Используя указанную методику, бычий ФРЭК, содержащийся в 8500 мл вытяжки из мозга быка (6,25 х 107суммарных единиц), концентрируют с выходом в сумме 6 мл альфаФРЭК (Зг,0 х 10 единиц) и 3 мл бета-ФРЭК (5,2 х 105 единиц).

Сущность изобретения состоит в получении ФРЭК и его фрагментов, не содержащих других белков человеческого происхождения. ФРЭК получают в клетках-реципиентах, при этом конструируют векторы экспрессии, : содержащие последовательность ДНК, кодирующую ФРЭК, трансформируют полученными рекомбинантами ДНК штаммы Е. coli клеток хозяев, осуществляют культивирование трансформаторов в условиях, обеспечивающих экспрессию ФРЭК, и выделяют белок. Вектор экспрессии ФРЭК конструируют путем получения дн-кДНК из мРНК ФРЭК и введения дн-кДНК в вектор. мРНК обогащают поли(А)содержащим мРНК материалом посредством хроматографии на олиго(оЧ)целлюлозе или поли(у)сефарозе с последующим элюированием фракции мРНК, содержащей поли(А)последовательность.

Поли(А)содержащую мРНК используют для синтеза комплементарной кДНК (он- кДНК), используя обратную транскриптазу.

Ё

00

о Јь

00

о

00

В результате синтеза ДНК у З -конца ДНК образуется шпилечная петля, инициирующая синтез двунитевой ДНК. При соответствующих условиях эту шпилечную петлю используют для осуществления синтеза дн- кДНК в присутствии полимеразы и деокси- рибонуклеотидтрифосфатов.

Вектор экспрессии обрабатывают с помощью эндонуклеазы рестрикции, которая образует по крайней мере два тупых или липких конца. Дн-кДНК встраивают в вектор.

Клоны, содержащие полные последовательности ФРЭК, идентифицируют, используя в качестве зонда вставку кДНК рекомбинантов ФРЭК, выделенных во время начального скриннинга библиотеки кДНК рекомбинантного фрагмента фага лямбда с олигонуклеотидами, специфическими к ФРЭК. Метод секвенирования нук- леотидов используют для определения последовательности аминокислот, кодированных фрагментами кДНК. Эту информацию можно использовать для определения клонов кДНК ФРЭК при сравнении с известной аминокислотой последовательностью аминоконца бычьего ФРЭК и пептида, выделенного в результате расщепления ФРЭК бромидом цианогена.

Приме р. А. Получение тотальной РНК.

Тотальную РНК (матричную, рибосом- ную и транспортную) экстрагируют из вытяжки ствола мозга человека двухдневной свежести. Клеточный осадок в пробирке после центрифугирования гомогенизируют в 5 объемах раствора, содержащего 4М тиоци- аната гаунидина и 25 мМ антивспенивателя А, Гомогенат центрифугируют в роторе в течение 15 мин при скорости 6000 об/мин при 10°С, Надосадочную жидкость доводят до рН 5,0 при прибавлении уксусной кислоты и РНК, осажденной 0,75 объемами этано- ла при -20°С в течение 2 ч. РНК собирают центрифугированием и растворяют в 7,5 М гидрохлорида гуанидина, содержащего 2 мМ цитрата натрия и 5 мМ дитиотреитола. После двух дополнительных осаждений 0,5 объемами этанола оставшийся хлоргидрат гуанидина экстрагируют из преципитата абсолютным этанолом. РНК растворяют в стерильной воде, центрифугированием удаляют нерастворимые вещества и осадок после центрифугирования повторно экстрагируют водой. РНК доводят до концентрации 0,2 М ацетата калия и осаждают при добавлении 2,5 объемов этанола в течение ночи при -20°С.

Б. Получение поли(А)содержащей РНК.

Преципитат тотальной РНК растворяют в 20 мМ Hepes-буфера (рН 7,2), содержащего 10 мМ ЭДТА и 1% додецилсульфат-на трия, нагревают до 65°С в течение 10 мин затем быстро охлаждают до 25°С. Раствор РНК затем разбавляют равным объемом воды и прибавляют NaCI для доведения конечной концентрации до 300 мМ NaCI. Образцы, содержащие до 240 Аато единиц РНК, хроматографируют на поли(/)сефаро- зе. Поли(А)содержэщую РНК элюируют 70%

раствором формамида. состоящим из 1 мМ Hepes-буфера (рН 7.2) и 2 мМ ЭДТА. Элюат устанавливают до концентрации 0,24 М NaCI и полученную РНК осаждают 2,5 объемами этанола при -20°С.

5В. Конструирование клонов кДНК в фаге лямбда.

мРНК (20 мкг) копируют в дн-кДНК с помощью транскриптазы и ДНК-полимера- зы. дн-кДНК обессоливают на сефэдексе G0 50 и фракции с незаполненным объемом дополнительно очищают.на колонке в соответствии с инструкциями изготовителя. При инкубации с Sl-нуклеазой получают дн- кДНК с тупыми концами. Реакционную

5 смесь, состоящую из 0,2 М цитрата натрия (рН 4,5), 0,4 М хлорида натрия, 2,5 мМ ацетата цинка и 0,1 ед. Sl-нуклеазы на нг дн- нДНК, доводят до конечного реакционного объема 100 мкг, дн-дДНК инкубируют при

0 37°С в течение 1 ч, экстрагируют смесью фенол-хлороформ и затем обессоливают на сефадексе G-50.

Дн-кДНК затем обрабатывают метила- зой Е, coRI и фрагментом Кленова ДНК-пол5 имеразы 1. кДНК опять обессоливают на сефадексе G-50. а затем лигируют с 0,5 мкг фосфорилированных линкеров Е. coRI, используя Т4 ДНК-лигазу. Полученную смесь расщепляют эндонуклеазой рестрикции Е.

0 coRI и фракционируют в 8% акриламидном геле в трис-боратном буфере. ДНК размером более 1 кб элюируют из геля и извлекают при связывании с колонкой, элюируют 1 М NaCI, а затем собирают преципитацией

5 этанолом.

Фрагменты ДНК затем вставляют в фрагмент gtn фага лямбда, расщепленного рестриктазой Е. coRI и обработанного фос- фатазой, используя ДНК-лигазу Т4. Получа0 ют библиотеку, состоящую из5,7х Юфагов, 65% которой составляют рекомбинантные фаги. Библиотеку фагов амплифицируют продуцированием штоков при 42°С на штамме Е. coll Y1088(sup-E supFmtc В trp R

5 hsdR hsd M+ ton A 21 str A lac И 169 (ргос::Тп5). К важным генетическим признакам указанного штамма относятся (1) sup F (необходимый для супрессии амбер-мута- ции фаза по S-гену), (2) hsd R hsd M+, необходимые для предотвращения рестрикции

чужеродной ДНК до модификации клетки- хозяина и (3) lac И 169 (ргос.:: Тп 5). и (4) (pMC9)(Lac 1-несущее производное плазми- ды pBR 322, которое подавляет в присутствии индуктора экспрессию чужеродных генов, которые могут разрушать фаг и/или подавлять клеточный рост.

Г, Идентификация клонов, содержащих ФРЭК-последовательности.

Для скриннинга библиотеки кДНК ФРЭК. содержащей рекомбинантные фаги, клетки фагов с титром 1,5 х 10 высевают на чашке на газон штамма Е. coli У1090 А ас И 169 pro А Д Ion ara D139 str A sup F (trp С 22 ::Тп 10)(рМС 9) и инкубируют при 42°С в течение 6 ч. После охлаждения чашек в холодильнике в течение ночи их накрывают нитроцеллюлозным фильтром. Положение фильтра маркируют иголкой. Через минуту фильтр удаляют и дают просохнуть при ком- натной температуре. С каждой чашки получают двойной фильтр, кроме того, что фильтр оставляют в контакте с чашкой в течение 5 мин. Затем готовят все фильтры для гибридизации. Указанная методика включает де- натурацию ДНК в 0,5 М NaOH с 1,5 М NaCI, нейтрализацию в буфере 1М трис-HCI, рН 7,5, и 1,5 М NaCI и нагревание фильтров в течение 2 ч в вакууме при 80°С.

Для скриннинга библиотеки кДНК ство- ла головного мозга человека для получения клонов, содержащих ФРЭК-вставки, конструируют специфический олигонуклео тид. Указанный олигонуклеотид базируется на анализе частичной аминокислотной после- довательности концевых аминогрупп ФРЭК. Бычий ФРЭК выделяют в виде двух форм, обозначенных как альфа-и бета-ФРЭК, которые отличаются только аминокислотами, обнаруженными у соответствующих амино- концов. Последовательность выводят из масс-спектрального анализа с быстрой атомной, бомбардировкой и определяют аминокислотный состав триптического пеп- тида с концевой аминогруппой. По-видимо- му, аминоконцевая блокирующая группа йцетилирована. Если интактный бета-ФРЭК расщеплен трипсином, то, как определено, вторая аминокислотная последовательность с аминоконцом, найденная в бета-, а не в альфа-ФРЭК, начинается с Phe Asn Leu... Данная последовательность также обнаружена у концевой аминогруппы кислого фибробластного фактора роста. Концевая аминогруппа ФРЭК представляет Asn Туг Lys ... и является эквивалентом бета-ФРЭК без аминоконцевой элонгации.

Для конструирования олигонуклеотида выбирают последовательность аминокислот lie Leu Pro Asn Gly Thr Val Asp Gly Т hi Lys, соответствующую 19 29 включениям аминокислот альфа-ФРЭК. Вместо созда- ния смеси из олигонуклеотидов. охватывающих все возможные кодирующие последовательности (вследствие деградации генетического кода), конструируют длинный уникальный олигонуклеотид. Такие олигонуклеотид-затравки, как показано ранее, являются эффективными зондами при скриннинге комплекс-ДНК.

При конструировании ФРЭК-зонда используют три критерия: (1) исключают ди- нуклеотидную пару CG. Данный подход основан на недостаточной встречаемости CG-nap динуклеотида в ДНК прокариота. В тех случаях, когда возможно, используют данные о предпочтительной утилизации ко- дона. Когда оба эти подхода не информативны, возможно необычное связывание пар оснований. Этот подход основан на природной частотности пар оснований G:T, I:T, 1:А и 1:С, которое возникает при взаимодействии между антикодонами тРНК и кодонами мРНК.

Примерно 30 моль олигонуклеотида ра- диоактивно метят путем инкубации с 32 р- гамма-АРТ и Т4 полинуклеотид-киназой. Полученные по методике, указанной выше, нитроцеллюлозные фильтры предварительно гибридизуют при 42°С в 6 х SSPE-буфере (1 xSSPE 0,18 М NaCI, 0,01 М(№НРСм)(рН 7,2), 0,001 М ЭДТА), 2 х Денхардт-раствора (1 х Денхардт-раствора содержит по 0,02% фикола, поливинилпирролидона, бычьего сывороточного альбумина), 5% растворе сульфата декстрана и 100 мкг/мл денатурированной ДНК спермы лосося. Через 4 ч вводят 42 Р-меченый олигонуклеотид и гиб- ридизацию продолжают в течение ночи при 42°С, Негибридизованный зонд удаляют в результате последовательного промывания при 37°С в 2 х SSPE-буфере и 0,1 % растворе ДДС натрия (SDS).

Из скриннированных 1,5 х 10 кланов 2 клона дают положительные радиравтогра- фические сигналы после экспозиции в течение ночи. Эти клоны очищают до гомогенного состояния повторными циклами очистки, используя вышеуказанный олигонуклеотид в качестве гибридизационного зонда.

Два клона, которые выделены, клоны 1 и 29 ФРЭК, анализируют более детально. При переваривании с Е. coRI в клонах 1 и 29 обнаруживают кДНК-вставки длиной 2,2 кб и 0,3 кб соответственно. При н к-трансля- ции клонированной кДНК и последующем ее использовании в качестве радиомеченого зонда в блот-гибридизации по Саузерну обнаруживают, что клоны 1 и 29 представляют собой связанные и перекрывающиеся клоны.

Более детально клоны 1 и 29 ан.ализиру- ют по следующей методике. Конструируют два дополнительных олигонуклеотида на основе аминокислотной последовательности бычьего ФРЭК. Указанные олиго- нуклеотиды конструируют на основе таких же подходов, которые используют при конструировании олигонуклеотида, применяемого для выделения клонов 1 и 29. Эти два нуклеотида, а также олиго(сП)18 радиоактивно метят в киназной реакции, как указано выше, и затем используют в качестве гибридизационных зондов в блот-анали- зе по Саузерну. Полученные данные этого анализа показывают, что кДНК-вставка 0,3 кб клона 29 гибридизуётся с I и II олиго- нуклеотидами ФРЭК, а не с III или олиго(с)Т)1- 8-нуклеотидами; кДНК-вставка 2,2 кб клона 1 гибридизуётся с I, II, III олигонуклеотида- ми, а также с олиго()18-нуклеотидом.

Из этих данных и последующего определения нуклеотидной последовательности клонов 1 и 29 видно, что З -конец клона 1 заканчивается поли(А)-хвостом. При гибридизации клона 1 с олигонуклеотидом III ФРЭК, которая происходит на основе вырезания цианогенбромидом продукта бычьего ФРЭК, а также с олиго (оТ)18-нуклеотидом указанный клон, как предполагают, включает оставшуюся кодирующую последовательность для альфа- и бета-форм ФРЭК, а также длинную (более 1 кб З -концевую фланкирующую последовательность.

Из клонов 1 и 29 выделяют кДНК-встав- ки, субклонируют в М13 р18, а открытую рамку считывания, кодирующую ФРЭК, и .фланкирующиеся области секвенируют по методу терминации цепи. При анализе нуклеотидной последовательности обнаруживают открытую рамку считывания из 464 нуклеотидов, кодирующую ФРЭК человека, Установлено, что 155 аминокислот ФРЭК человека фланкированы кодонами блокировки трансляции. Аминокислотой с концевой NHa-группой бета-ФРЭК человека, выделенной из кДНК-последовательности, является метионин, который, по всей вероятности, выступает в качестве остатка инициации трансляции. На основе указанных данных, а также с негидрофобной природой первых 15-20 аминоконцевых остатков высказывается предположение, что бета-ФРЭК человека синтезируют без сигнального пептида с концевой МН2-группой. Аминокислотная последовательность с концевой аминогруппой бычьего бета-ФРЭК, расщепленная трипсином, а также бычьего

альфа-ФРЭК идентична аминокислотной последовательности, выведенной из последовательности нуклеотидов клонов 1 и 29 лямбда ФРЭК. Полная гомология между

двумя указанными видами, как установлено, составляет более 95%.

При Northern-блот-анализе устанавливают, что мРНК ФРЭК представляет вид единичной молекулы, которая мигрирует

вместе с 28 S рРНК. С учетом допускаемой погрешности в расчетном размере 28 S рРНК приблизительный размер мРНК ФРЭК составляет 4,8 ±1,4 кб. Последовательности, кодирующие зрелые формы как

альфа-, так и бета-ФРЭК, закодированы в пределах клонов 1 и 29 ФРЭК, которые вместе имеют размер примерно 2,3 кб. Таким образом, указанные данные демонстрируют, что область 5 и фланкирующая последовательности, кодирующие ФРЭК. довольно протяженные (примерно 2,5 ±1,4 кб).

Из клонов 1 и 20 вырезают кДНК-встав- ки посредством гидролиза Е coRI и субклонируют в pv08 у сайта Е coRI. Плазмиду,

сконструированную из клона 1, обозначают как pDH 13, а плазмиду, образованную из клона 29, как pD H14. Указанные плазмиды депонируют в Американской коллекции типовых культур, 12301 Parklawn Drive,

Rockvtll АТСС 20852. Плазмиде из клона 1, то есть pD H15, присваивают номер АТСС 53336, а плазмиде из клона 29. то есть pD Н14,-АТСС 53335.

Таким образом, указанный пример

представляет экспериментальные методики, которые предусматривают получение фактора роста эндотелиальных клеток человека, не содержащих других белков челове- . ческого происхождения.

ФРЭК применяют для выращивания и амплификациии эндотелиальных клеток в культуре. В настоящее время ФРЭК, используемый для выращивания клеток, экстрагируют из бычьего мозга. Этот

неочищенный бычий ФРЭК является мито- геном эндотелия аллантоисной вены человека. Использование гепарина с ФРЭК и матрикса на основе фибропектина позволяет получить стабильные клоны эндотелиальных клеток. Рекомендуемая концентрация сырого бычьего ФРЭКдля использования в качестве митогена in vitro составляет 150 мкг на мл питательной среды.

Рекомбинантный ФРЭК человека, полученный таким образом, пригоден в качестве замены бычьего неочищенного ФРЭК при культивировании In vitro эндотелиальных клеток человека и других мезенхимных клеток для научных исследований. Полагают, что активность ФРЭК человека в условиях роста эндотелиальных клеток такая же или превосходит активность бычьего ФРЭК вследствие высокой гомологии в аминокислотных последовательностях обоих белков. Предполагаемый предел эффективной дозы для усиления клеточного деления и роста In vitro составляет 5-10 нг очищенного ФРЭК на 1 мл питательной среды.

Рекомбинантный ФРЭК человека также пригоден для активации клеточного роста в протезном приспособлении, а не в склянке или колбе для культивирования тканей. Это приспособление может быть покрыто или не покрыто другими молекулами, которые дол- жны способствовать прикреплению эндотелия к указанному устройству. Такие молекулы могут включать белки с внутриклеточным матриксом (например, фибронек- тин. ламинин или один из коллагенов), человеческий сывороточный альбумин гепа- рин или другие гликозамингликаны или инертные органические молекулы,. Эндоте- лиальные клетки культивируют на этих поверхностях с использованием эффективных доз ФРЭК в питательной среде, покрывая их монослоем эндотелия. В результате этого получают поверхность, предупреждающую образование тромбов в приспособлении для протезирования, тем самым уменьшая опасность возможных случаев закупорки тромбами, которые угрожают жизни, вследствие имплантации этих протезов.

Так, разработан иммунологический анализ с помощью двойного антитела для бычь- его ФРЭК. В этом анализе 96-луночные планшетки из поливинилхлоридэ покрывают антиФРЭК кролика и остающиеся участки связывания затем блокируют, используя 10%. стандартную сыворотку кролика. Да- лее образцы ФРЭК вводят в лунки и инкубируют, После промывки прибавляют ФРЭК с

моноклональными антителами мыши. После инкубации и нескольких промывок прибавляют связанные пероксидазой IgG мыши с антителом из кролика. Реакционный продукт квэнтируют спектрофотометрически после конверсии 0-фенилендиамина в присутствии перекиси водорода. Аналогичный иммуноанализ можно использовать для установления дозировки ФРЭК в зависимости от состояния болезни, которая воздействует на рост эндотелиальных клеток. Очищенный РЭК-продукт пригоден в качестве стандартного реагента для количественного определения-неизвестных образцов ФРЭК.

ФРЭК также может быть потенциальным средством при лечении поврежденных или для регенерации кровяных сосудов или других строений организма с покровом эндотелиальных клеток.

Формула изобретения

Способ экспрессии митогенного белка эндотелиальных клеток человека в Escherichia coli, заключающийся в том. что выделяют нРНК из вытяжки ствола мозга человека, получают из мРНК поли(А+)мРНК, синтезируют кДНК с помощью указанной мРНК, колонируют кДНК в вектор лямбда gt 10 или лямбда gt 11, отбирают клоны кДНК, кодирующие митогенный белок эндотелиальных клеток путем гибридизации указанных клонов с олигонуклеотидной пробой, имеющей следующую нуклеотидную последовательность:

ATT TTT CCI GAT GGI ACI GTI GAT GGI

ACI ААА,

субклонируют кДНК из отобранных клонов в плазмиду pU C8, выделяют плазмидные ДНК pDH14 и pDH15,трансформируют полученными ДНК штамм-реципиент с последующим отбором трансформированных клонов и индукцией экспрессии целевого белка.

Изобретение относится к генетической инженерии, в частности к синтезу митоген- ного эндотелиального белка методом ре- комбинантных ДНК. Конструируют рекомбинантные плазмидные ДНК, кодирующие фактор роста эндотелиальных клеток человека, трансформируют полученными ДНК штаммы реципиентов Е. coli, культивируют трансформанты в условиях, обеспечивающих экспрессию белка, и выделяют целевой продукт.