Способ получения комплексного соединения платины (II) с Н-ДНК, обладающего противоопухолевой активностью Советский патент 1993 года по МПК C07F15/00 A61K31/295 

Изобретение относится к способу получения нового комплексного соединения платины, обладающего противоопухолевой активностью.

Целью изобретения является получение нового платиноорганического комплексного соединения с более высокой активностью и более низкой токсичностью по сравнению с известными противоопухолевыми препаратами.

Способ получения полиплатиллена заключается в том, что предварительно нагретые до температуры плавления н-ДНК водные цитратно-солевые растворы цисдихлордиамминплатины и н-ДНК смешивают в молярном соотношении Pt:P:NaC :Na3Cyt 6:4:30:3 и термостатиру- ют при этой температуре до окончания реакции.

Нативную ДНК растворяют в цитратно- солевом растворе (15 ммоль/л NaCI 1,5 ммоль/л NasCyt) при комнатной температуре и нагревают в термостате до Тпл.

Цис-дихлордиамминплатину (П) растворяют в таком же цитратно-солевом растворе, предварительно нагретом до температуры плавления н-ДНК.

00

д

СлЭ

00

ю

Окончание взаимодействия ДДП и н- ДНК контролируют спектрофотометрически по достижению параметров УФ-спектра поглощения Амакс. 266,2+0,1 НМ И Е266.2 10000+100 л.моль 1см 1.

Заявляемое вещество получают в водном растворе и в твердом виде как индиви- дуальное вещество или как смесь с NaCI+Na3Cyti5,5«H20.

Пример 1. Высокомолекулярную н-ДНК с температурой плавления 78,0+0,°С в количестве 0,500 г растворяют при комнатной температуре в 0,375 л водного раствора, содержащего 15 ммоль/л NaCI + 1,5 ммоль/л NaaCyt в дальнейшем такой раствор будет называться цитратно-солевым) и нагревают раствор с термостате до 78,0±0,5°С со скоростью 1°С в минуту.

Препарат ДДН в количестве 0,675 г растворяют в 0,375 л цитратно-солевого раствора, предварительно нагретого в термостате до 78,OtO,5°C.

Приготовленные растворы н-ДНК и ДДП смешивают при 78,0+0,5°С, тщательно перемешивают и термостатируют при 78,0+0,5°С еще в течение 15 мин.

Пример 2. Опыт проводят как в примере 1, только реакционную смесь подвергают лиофильной сушке по методике изготовления сухой плазмы крови.

Раствор полиплатиллена, полученный по реакции при постоянном вращении, охлаждают до минус 40°С в течение 40 мин, выдерживают при этой температуре 12 ч, а затем температуру повышают до минус 20°С, образец откачивают в течение 40 ч, нагрева ют до плюс40°С и снова откачивают 26 ч, Полученный после лиофильной сушки лиофилизат представляет собой сложное вещество, состоящее из полиплатиллена, NaCI и NasCyt 5,5 НзО в мольном соотношении Pt:P:NaCI:Na3Cyt 6:4:30:3.

Пример 3. Опыт проводят как в примере 2, только из полученного после лиофильной сушки сложного вещества (лиофи- лизата) удаляют NaCI и №зСу1 5,5 Н20. Для этого к 0,250 г лиофилизата добавляют 50 мл дистиллированной воды и тщательно перемешивают. Полученную известь центрифугируют при комнатной температуре со скоростью 7000 об/мин в течение 15 мин на центрифуге ОПн-8. Осадок отделяют от над- осадочного раствора декантацией, промывают водой, спиртом, эфиром и сушат на воздухе. Сухое вещество хранят .при комнатной температуре в закрытой стеклянной посуде. Выход чистого полиплатиллена составляет 60% от теоретического.

Для экспериментальной проверки заявляемого способа получения полиплатиллена было проведено еще 22 опыта, 10 из которых показали положительные результа- ты. В положительных опытах получен продукт, УФ-спектры которого имеют параметры, характерные для заявляемого соединения. Результаты опытов сведены в табл. 1, где приведены характеристики пол0

ученных продуктов в зависимости от способа их получения. Способы получения охарактеризованы следующими параметрами; выбором концентрации исходных растворов ДДН и н-ДНК, молярным

5 соотношением Pt:P:NaCi:Na3Cyt 5,5 HzO, временем и температурой проведения реакции.

Из табл. 1 следует, что выбор исходных концентраций ДДН и н-ДНК в пределах

0 ошибки опыта не влияет на характеристики полученного продукта (опыты 1-6). Максимальная концентрация ДДН ограничена ее растворимостью, составляющей 0,2523 мас.% при250°С, Минимальная концентра5 ция ДДП ограничена минимально возможной для хорошей спектрофотометрической регистрации концентрацией н-ДНК, составляющей 3,0 мкг/мл. Опыты 7-12 показали, что отклонение от соотношения

0 Pt:P:NaCI:Na3Cyt в сторону избытка одного из компонентов не позволяет получить целевое соединение полиплатиллен с выше указанными параметрами УФ-спектра. Результаты опытов 13-16, указывают

5 что взаимодействие реагентов по реакции протекает быстро и заканчивается за время, не превышающее 5 минут. Увеличение времени термостатирования реакционной смеси до 30 минут не влияет на параметры

0 продукта реакции.

Результаты опытов 17-22 говорят о существенном влиянии температуры проведения реакции на такой параметр продукта реакции как E26G.2. Из зависимости Ё266.2 от

5 температуры видно, что для получения заявляемого соединения полиплатиллена тер- мостатирование реакционной смеси надо вести при 78+0,5°С. За пределами указанного температурного интервала нельзя пол0 учить продукт с необходимыми параметрами УФ-спектра.

Приведенные лишь данные позволяют заключить, что смешением предварительно нагретых до температуры плавления н-ДНК

5 водных .цитратно-солевых растворов н- ДНК и цис-дихлородиаммин-платины (II) в молярном соотношении Pt:P:NaCI:Na3Cyt 6:4:30:3 с последующим термостатированием при этой температуре в течение времени, необходимом для окончания реакции, позволяет

получить соединение, характеризуемое формулой (МНз)(Н20)}п- ДНК с нижеописанными физико-химическими свойствами. Соединение представляет собой биологически активное высокомолекулярное вещество, которое способно эффективно тормозить рост опухоли и увеличивать продолжительность жизни организма при низкой токсичности и тем самым превосходит известные противоопухолевые препараты.

Заявляемое вещество, полиплатиллен, существует в растворе и в твердой фазе в виде смеси с хлоридом натрия и цитратом натрия (формула цитрата натрия - №зСбОуН5 5,5 Н20, сокращенно- NaaCytJ n как индивидуальное вещество. Смесь полиплатиллен а с хлоридом натрия и цитратом натрия представляет собой порошок желтого цвета. Индивидуальное соединение - мелкокристаллический светлокоричневый порошок. Оно устойчиво в растворах и в твердом виде, способно длительное время храниться в воздухе и в холодильнике без изменения свойств. Состав и строение соединения определены на основе химико-аналитических и физико-химических исследований твердых образцов и растворов.

Элементный анализ соединения в смеси с солями натрия и в индивидуальном состоянии подтверждает состав синтезированного целевого продукта лолиплатилле- на. Для смеси (МНз)(Н20)б- }п-уМ-ДНК +

+ ЗОп NaCI + ЗпМазСбОуНб 5,5 Н20.

Найдено, %: Pt 20.41: CI22.10: С 11,29: N 5,07; Р 1,99; Н 2,06: Na 15.40.

Вычислено.%: Pt 20,23: С 22.1-0: С 11,83; N5,08; Р 2,14; Н 2,19; Na 15,51.

Для индивидуального соединения поли- платиллена

Найдено,%: Pt 39.81; CI 7,40; С 15.62; N 10,11;Р 4,38; Н 2,83.

Вычислено,0/,: Pt 39.58; С 7,21; С 15,83; N 9.95; Р 4,19; Н 2,67.

Измеренная вискозиметричееким ме- тодрм молекулярная масса полиплатиллена оставляет 6,2 106 дальтонов. Рассчитанная на основе данных о среднестатической молекулярной массе полипропиллена и массы его среднестатической мономерной единицы формулы (среднестатическая величина п 2100Ј100)

{{PtCI(NH3)(H20)KC39H49032Nl5P4)}.

Следовательно, в среднем, на 2000 нуклео- тидных квартетов ДНК, состоящих из пар аденин-тимин, гуанин-цитозы, приходится примерно 120QO комплексных частиц {PtCI(NH3XH20)f. :

Полученный в индивидуальном виде полиплатиллен плохо растворяется в воде. Его растворимость повышается в присутствии солей натрия (NaCI + NasCyt). Так при 20°С 5 растворимость препарата в дистиллированной воде составляет всего 0,0005%, а в растворе, содержащем 18 ммоль/л NaCI и 1,8 ммоль/л NaCyt - 0,005%. Значительно лучше, чем индивидуальное вещество, растер0 ряется полиплатиллен, полученный в смеси с NaCI + NaaCyt: растворимость такого образца в воде при 2°С равна 0.015%. Однако и эта величина на порядок ниже максимально достижимой концентрации соединения,

5 полученного в растворе, Пониженная растворимость твердых образцов говорит о необратимой десольватации полиплатиллена при его выделении из водного раствора, что обуславливает необходимость использо0 . вать суспензии твердых образцов при биологических испытаниях.

Раствор чистого полиплатиллена практически не проводит электрический ток, что свидетельствует об отсутствии электролитй5 ческой диссоциации при его растворении.

УФ-спектры образцов полиплатиллена, полученных в водном растворе и выделенных в твердом виде индивидуально или как смесь с NaCI+NaaCyt, после растворения в

0 воде характеризуются максимальным поглощением Амакс. - 266,2 нм, тогда как для свободной н-ДНК Амакс. 258,0 нм. Молекулярный коэффициент поглощения полиплатиллена в расчете на моль нуклеотида, Е 266,2

5 10000 л , а у н-ДНК - Е258,о

. 7000 л, . Смещение максимума

поглощения в длинноволновую область на

8,2 нм у полиплатиллена по сравнению с

н-ДНК говорит о связывании макромолёку0 лы с платйноеодержащмми группировками в результате образования ковалентных связей между ионом металла и донорными атомами азота оснований ДНК. Более высокая величина длинноволнового смещения УФ5 максимума поглощения у полиплатиллена, ДА 8,2 нм, по сравнению с аналогичной величиной ДЯ 7,7 нм для соединения РЮН- ДНК, свидетельствует о том/что, в среднем, ковалентные связи между платиной и осно0 ваниями ДНК в подиплатиляене прочнее, чем в соединении PtOH-ДНК: Сопровождающий это связывание гиперхромный эффект составляет 30%, указывая на сильные конформационные изменения двойной спи5 раяи ДНК при взаимодействии с металлом. Изменения в ЙК-спектрах полиплатиллена по сравнению со свободной ДНК свидетельствуют о том. что металл в нем связывается не только с азотистыми основаниямиДНК, ной с атомами кислорода фосфатных групп. При 1225 и 1060 см находятся полосы валентных колебаний фосфодиэфирных мостиков ДНК. В области 1500-1700 наблюдаются полосы валентных колебаний , , азотистых оснований ДНК, в области 300,0-3700 см-1 полосы валентных колебаний групп С-Н, N- Н, О-Н, входящих в состав ДНК и молекул воды. Кроме того, при 340 см наблюдается валентное колебание PtCI, при 1340 см деформационное колебание координированной молекулы NHs.

По данным термического анализа чистый полиплатиллен не теряет молекулу воды даже при нагревании до 200° С, что Свидетельствует о ее прочном связывании. Смесь полиплат иллена с NaCI + NaaCyt 5,5 Н20 при прогревании до 200°С теряет кристаллизационную воду цитрата натрия. Найдено, что потеря воды для смеси полиплатиллен + Nad + NaaCyt 5,5 НаО составляет 5,10%, а вычисленное количество кристаллизационной воды равно 5,13%.

Спектры отражения твердого полипла- тиллёна имеют значения коэффициентов спектрального отражения, R,%, в экстремальных точках, отличие от значений R для ДДП. Для смеси полиплатиллен + NaCI + NaaCyt 5.5 ЖО R267.1 8,97; ,28; в то время как для ДДП R242.2 9,7, R269J 13,6; Рззз.з 10,4: Rs4o 17.10: R414,,80; Rsi4.4 50,57.

Спектры отражения подтверждают, что полиплатиллен представляет собой вещество, содержащее комплекс платины, состав координационной сферы которого изменен за счет замещения одной молекулы аммиака и одного аниона хлора молекулой воды и фрагментами ДНК. Данные элементлого анализа, вискозиметрии, кондуктометрии, УФ- и ИК-спектров поглощения, а также спектров отражения свидетельствуют о том, что синтезированное соединение действительно высокомолекулярное вещество - по- ли{гексакис хлороамминакваплатина(П)}- -дезоксирибонуклеат формулы

{ Р1С1{МНз)(Н20)6}п-/г-ДНК

В табл. 2 представлены результаты испытаний токсичности и противоопухолевой активности заявляемого соединения и соединения PtOH-ДНК, выбранного в качестве базового. Опыты проводили на мышах и крысах обоего пола разведения питомника Столбовая.

Токсичность изучали на группах животных из половозрелых нелинейных мышей весом 30,0+2,0 г, прошедших карантин 20

дней (в каждой группе было по 10 животных), Препараты вводили внутрибрюшин- но трехкратно с интервалом в два часа по 0,5 мл. Для инъекций PtOH-ДНК использовали

водные растворы, а для инъекций полипла- тиллена - цитратно-солевые растворы (водный раствор, содержащий 15 ммоль/л NaCI и 1,5 ммоль/л NasCyt) или водные суспензии его твердых образцов, представляющих собой индивидуальное вещество или его смесь с NaCI + NasCyt.

Суммарные дозы препаратов составляли 34,0. 68,0, 84,0,102,0 и 136,0 мг/кг. Количество погибших животных в каждой группе

отмечали через каждые 24-48 часов расчет токсичной дозы, ЛДво, проводили по методике. Летальную дозу, ЛДюо, определяли экспериментально.

В результате проведенных опытов установлено. что для соединения PtOH-ДНК ЛДзо 66,0, ЛДзо 100 мг/кг. Токсичность полиплатиллена зависит от формы его введения. Для препарата, полученного в растворе, ЛДбо 102,0, а ЛДюо 136,0 мг/кг;

для препарата, выделенного индивидуально или в смеси с NaCI + NasCyt 5,5 НгО 82,5, ЛДбо 120,0 мг/кг. Из сравнения приведенных величин следует, что токсичность полиплатиллена значительно ниже, чем у

соединения PtOH-ДНК. Особенно снижена токсичность у полиплатиллена. полученного в:растворе.

Согласно гистологическим исследованиям гибель животных, получавших токсические дозы препаратов обусловлена энтеротоксичностью. Имеет место выраженная дисплазия клеток эпителия в кишечнике, нарушение его регенераторной функции, сокращение количества митозов.

Незначительные изменения отмечены в почках: небольшой отек стромы. зернистая дистрофия канальцев, мелкоочаговые кровоизлияния.

Противоопухолевую активность каждого из препаратов оценивали из экспериментов, проведенных на пяти группах животных (в каждой группе по 10 животных). Белым беспородным крысам весом 150-200 г под кожу бедра трансплантировали 2 -108 - 2

10-10 клеток перевивного штамма лейкоза Швеца. Животные I группы служили для контроля, II группа получала соединение PtOH- ДНК, III - полиплатиллен, полученный в растворе, IV-полиплатиллен, полученный в

смеси с NaCI+Na3Cyt 5,5 Н20, V - полиплатиллен, полученный в индивидуальном виде. Препараты вводили внутрибрюшинно трехкратно на 4-6 сутки после трансплантации опухоли, т.е. в период логарифмической фазы ее роста, второй и третий раз - с интервалами 24-48 ч соответственно. Суммарные дозы препаратов составляли 27.3 мг/кг в расчете на чистый препарат.

Противоопухолевую активность оценивали по следующим физиологическим показателям:

- по объему опухоли, V (см3):

- по степени угнетения роста опухоли (Т/С, %);

- выживаемости животных на 10-е сутки (ВЖ,%);

- продолжительности жизни животных (ПЖЖ, сутки).

Расчеты производили по следующим формулам:

V |±.

где mi, ГЛ2. тз - три взаимно-перпендикулярных измерения опухолевого узла;

VKOH -Von

т/с

VK

100,

где VKOH и Von - объем опухоли в контрольной и опытной группах соответственно;

RS.X -А-100

ВЖ--fl-.

где А - число животных на 10-е сутки после трансплантации опухоли.

N - число животных в данной группе.

ПЖЖ определяли по числу суток, прошедших от момента перевивки опухоли до гибели последнего животного в данной труппе. Данные о биологической активности полиплатиллена. приведенные в таблице, подтверждены актом испытаний противоопухолевой активности и токсичности.

Анализ данных, представленных в табл. 2 показывает, что препарат РЮН-ДНК по сравнению с контролем тормозит рост опухоли на 94%. Его применение позволяет получить 100%-ную выживаемость животных. В то же время продолжительность жизни животных при его применении уменьшается на 3-е суток по сравнению с контролем, т.е. с нелеченными животными. Противоопухолевая активность полиплатиллена не зависит от формы ведения препарата. Во всех случаях он тормозит рост опухоли на 95%, обеспечивает 100%-ную выживаемость животных. В то же время продолжительность их жизни увеличивается по сравнению с контролем на 7-8 суток, а по сравнению с PtOH-ДНК - вдвое, т.е. на 10+1 суток.

Сравнительный анализ данных, приведенных в таблице, позволяет заключить, что заявляемое соединение, полиплатиллен,

менее токсично, чем препарат PtOH-ДНК, особенно если его применять в виде препарата, полученного в растворе. По уровню противоопухолевой активности и выживае- 5 мости не уступает соединению РЮН-ДНК, а по такому показателю, как продолжительность жизни, существенно превосходи его, так как увеличивает продолжительность жизни в два раза.

0 Таким образом, создание высокомолекулярного соединения платины (II) с ДНК, полиплатиллена, привело к получению вещества более эффективного, чем известные противоопухолевые препараты, так как по

5 показателям физиологической активности, характеризующим его противоопухолевый эффект, предлагаемый препарат превосходит или сопоставим с известными веществами и выгодно отличаается от них из-за

0 уменьшения токсичности.

Выявленный комплекс свойств: высокие показатели степени торможения роста опухоли, выживаемости животных и продолжительности их жизни при одновременном

5 снижении токсичности делает предложенное соединение перспективным для создания препаратов, эффективных для лечения злокачественных опухолей,

Дополнительным преимуществом пред0 латаемого противоопухолевого вещества является обеспечение им возможности расширить ряд высокомолекулярных платино- содержащихпротивоопухолевых препаратов и тем самым обеспечить пре5 одоление эффекта привыкания организма к платиновым противоопухолевым средствам.

Способ обеспечивает также получение вещества в растворе и в твердой фазе как

0 индивидуального соединения в чистом виде и как смеси его с хлоридом и цитратом натрия.

Формул а изобретения Способ получения комплексного соеди5 нения платины И) с н-ДНК, обладающего противоопухолевой активностью, взаимодействием цис-дихлордиаминплатины с дезоксирибонуклеиновой кислотой, выделенной из селезенки крупного рога0 того скота, марки А при нагревании до 78,0+0,5°С в водной среде, о т л и чающ и й- с я тем, что, с целью получения соединения с более высокой активностью и более низкой токсичностью, процесс проводят в при5 сутствии хлористого натрия и цитрата натрия при молярном соотношении платины, фосфора, н-ДНК, хлористого натрия и цитрата натрия равном 6:4:30:3 в течение 15-20 мин.

Таблица 1

Таблица 2

Изобретение касается комплексных соединений пластины (2+), в частности получения комплекса соединения платины (2+) с н-ДНК, обладающего противоопухолевой активностью, что может быть использовано в медицине. Цель - повышение активности и снижение токсичности целевого продукта. Для этого ведут реакцию цис-дихлордиами- ноплатины с дезоксирибонуклеиновой кислотой (выделенной из селезенки крупного рогатого скота, марки А) в присутствии NaCI и цитрата натрия при молярном соотношении 6:4:30:3, при нагревании до 78+0,5°С в течение 15-20 мин в водной среде. Полученный продукт обеспечивает 95%-ное торможение роста опухоли при 100%-ной выживаемости животных. 2 табл.