СПОСОБ СИНХРОНИЗАЦИИ КЛЕТОК В G1-ФАЗЕ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА Российский патент 1997 года по МПК C12N5/02 C12N5/00 

Описание патента на изобретение RU2088661C1

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способам получения клеток в определенной фазе клеточного цикла, и может быть использовано для получения клеток, синхронизированных в пресинтетической фазе клеточного цикла.

Как известно, наибольший интерес для биотехнологии представляют клетки в пресинтетической фазе (GI-фазе) клеточного цикла, в которых обеспечивается эффективный биосинтез вирусных препаратов, антигенов, ферментов, алкалоидов, инсектицидов и других биологически активных веществ.

Известен способ получения клеток в GI-фазе клеточного цикла, заключающийся в выращивании монослойной клеточной культуры, отделении и накоплении клеток в GI-фазе (Presscott D. M. Reprodaction of eu Karyotic cells, NY, 1976-1977 p). Для реализации способа культуру высевают на стерильные матрасы в ростовой питательной среде. Клетки культивируют в течение 24 ч. Затем стерильные матрасы интенсивно встряхивают, что обеспечивает преимущественное отделение клеток в GI- фазе от субстрата. Отделенные клетки отбирают вместе с питательной средой. Культивирование клеток с последующим отделением клеток GI-фазе повторяют многократно. Отобранные клетки накапливают и хранят при низкой температуре.

Недостатками указанного способа является низкий выход конечного продукта, ограниченный особенностями клеточного цикла данной культуры клеток; его загрязнение клетками, находящимися в митозе (G2-М-фазе); механическое повреждение клеток при встряхивании; возможность выполнения способа только в условиях стационарного культивирования; многоэтапность и длительность процедуры получения клеток в GI-фазе, что исключает его использование в промышленных условиях.

Известен способ получения клеток в GI-фазе цикла, состоящий в выращивании клеток в суспензии или монослойной культуре с последующим разделением клеток на фракции и отделением той фракции клеток, которая содержит клетки в GI-фазе (Pretlow T.G. Pretlow T.P. Cell, Separation. Academic Press London and NY, 1982, Vol 1 p.44). Культивирование клеток осуществляют в стерильных условиях в монослойной или суспензионной культуре в ростовой питательной среде в течение 24 ч (обеспечивается полный клеточный цикл). Затем ростовую среду удаляют и выращенные клетки суспендируют в сбалансированном солевом растворе. Полученную суспензию клеток, содержащую клетки в трех фазах клеточного цикла GI-фазе, М-фазе и G2-M-фазе, направляют на разделение методом ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы с последующим отбором фракции клеток в GI-фазе и их накоплением.

Как следует из технической сущности известного способа, выход клеток в GI- фазе зависит от природы клеток в культуре и ограничен особенностями клеточного цикла. Кроме того, способ трудоемок, имеет ряд промежуточных этапов, требует использования дорогостоящих аппаратуры и реактивов, что лимитирует его применение в промышленных условиях.

Подтверждением указанных недостатков способа являются данные, полученные при реализации известной технологии с использованием культуры клеток HEP-2, Vero, СПЭВ, RH. Культуру клеток в посевной концентрации 2•105 кл/мл высевают в стерильные матрасы вместимостью 1,5 л в 150 мл ростовой питательной среды, содержащей 10% сыворотки крови крупного рогатого скота, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 ЕД/мл стрептомицина. Клетки культивируют 24 ч при температуре 37oC. Затем среду роста заменяют равным объемом раствора Версена для снятия клеток с субстрата. Полученную суспензию клеток центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин для удаления раствора Версена.

Осадок, содержащий клетки в GI-, S- и G2-M-фазах клеточного цикла, суспендируют в сбалансированном солевом растворе (р-ры Хенкса, 199, Игла), наслаивают на градиент плотности сахарозы и подвергают ультрацентрифугированию при 30000 об/мин в течение 30 мин при 20oC. Собирают отдельные фракции и осуществляют определение качественного и количественного состава каждой фракции методом проточной цитофлюориметрии после комбинированного окрашивания ядер (Культура животных клеток. Методы. /Под ред. Р.Фрешни. М. Мир, 1989. с.204, 333). Для этого к 0,8 мл суспензии полученных клеток в концентрации 1•106 кл/мл добавляют последовательно 0,1 мл 1%-ного раствора Тритона Х-100; 0,02 мл 0,01% раствора бромистого этидия; 0,04 мл 0,01% раствора оливомицина и 0,05 мл раствора магния хлорида с молярной концентрацией 0,03 моль/л. Окрашивание проводят на лазерном проточном цитофлюориметре "FACStar" фирмы BECTON DISKINSON USA по программе DNA Cell - Cycle Analysis Soffwarever C 5/87 Sum of Broadened Rectangles Model.

Расчет относительного содержания клеток, находящихся в различных фазах цикла, проводят на основании анализа полученных гистограмм и выражают в процентах. Данные представлены в табл.1, примеры 1 12.

Как следует из представленных данных, известный способ обеспечивает высокую эффективность фракционирования клеток. Однако выход клеток в GI-фазе зависит от вида клеточной культуры и ограничен свойствами клеточного цикла, т. е. для накопления значительного количества клеток в GI-фазе необходимо обработать большой массив клеточной культуры. Таким образом, известный способ характеризуется недостаточно высокой производительностью процесса получения клеток в GI-фазе, требует для реализации дорогостоящее оборудование - центрифуги, что ограничивает его промышленное использование.

Анализ патентной и научно-технической литературы показывает, что известные способы получения клеток в GI-фазе основаны на фракционировании общей массы культивируемого материала, содержащего одновременно клетки в GI-фазе, S-фазе и G2-M-фазе клеточного цикла, отделении и накоплении клеток в GI-фазе.

Известен способ синхронизации клеток с использованием таких агентов, как метотрексат, тимидин, 5-фтордезоксиуридин, предлагаемый в качестве наиболее близкого аналога (Методы вирусологии и молекулярной биологии, М. Мир, 1972, с.23-27). Указанные вещества обеспечивают синхронизацию клеток и действуют в S-фазе роста.

В основу изобретения поставлена задача разработать способ синхронизации клеток в GI-фазе клеточного цикла, в котором специальная обработка клеток культуры, независимо от способа ее культивирования комплексным производным платины, привела бы к получению функционально однородного (гомогенного) пула клеток, синхронизированных в GI-фазе, достижению высокой производительности технологического процесса, обеспечению возможности обрабатывать неограниченный объем клеточной культуры, что позволит применять предложенный способ в промышленных условиях.

Для решения поставленной задачи предложен способ синхронизации клеток в GI-фазе клеточного цикла, состоящий в инкубировании выращенных клеток в присутствии цис-дихлордиаминплатины (П) формулы (1) PtCl2(NH3)2 или производных платины (П) с полианионом дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) общей формулы (П) [PtCl(NH3)]6(OH)x(H2O)y} n•ДНК-m,
где

n 2000 ± 200
при x=0; y=12; m=6n; r=6;
x=2; y=10; m=4n; r=4;
x=0; y=6; m=6n; r=6.

При этом концентрация соединения платины формулы (1) составляет (5,3 - 530)•10-8 г/дм3, а концентрация соединения платины общей формулы (П) составляет (0,9 900)•10-4 г/дм3.

В ходе исследования установлено, что при инкубировании выращенной массы клеточной культуры, содержащей клетки в GI-, S- и G2-M-фазах клеточного цикла, в присутствии заявляемых комплексных соединений платины, создаются условия, обеспечивающие блок клеточного цикла на уровне S-фазы и накопление клеток в GI-фазе; при этом клетки, уже находящиеся в момент блокирования в S-и G2-M-фазах продолжают клеточный цикл до момента их вступления в GI-фазу.

Таким образом, в процессе инкубирования клеток культуры происходит регуляция клеточного цикла под воздействием соединений платины, в результате достигается практически полная синхронизация клеток а GI-фазе, на 95 100% При этом независимо от способа культивирования клеток культуры значительно увеличивается производительность технологического процесса синхронизации клеток в GI-фазе в 1,3 5 раз для культур СПЭВ, НЕР-2, Vero и RH; неограниченно возрастает объем перерабатываемой клеточной массы, что делает предложенный способ технологичным и экономичным.

Используемые в предложенном способе комплексные производные платины известны: цис-дихлордиамминплатина (П) описана в (Rosenberg B. Clinical aspects of platinum anticancer drugs / Metal ions Biol. syst. 1980, p.127-196); производные платины (П) с полианионом дезоксирибонуклеиновой кислоты (патент EP N 0374267, кл. A 61 K 35/28, 31/555, 1990). Указанные соединения являются активными компонентами противоопухолевых лекарственных препаратов и, как следует из анализа патентной и научно-технической литературы, не применялись для регуляции клеточного цикла в биотехнологии. Впервые был обнаружен неожиданный эффект возможность регулирования клеточного цикла в присутствии комплексных соединений платины для синхронизации клеток в культуре в GI-фазе.

Таким образом, известные комплексные соединения платины использованы в предложенном решении по новому, ранее неизвестному назначению.

Способ реализуется следующим образом.

Предварительно выращивают массив клеточной культуры. Культивирование клеток осуществляют в стерильных условиях в монослойной или суспензированной культуре в ростовой питательной среде в течение 24 ч при 37oC. Затем среду роста заменяют равным объемом сбалансированного солевого раствора, содержащего комплексные соединения платины в заявляемых концентрациях и инкубируют в течение 6 8 ч при 37oC. После окончания инкубирования получают конечный продукт синхронизированную в GI-фазе монослойную клеточную культуру или взвесь клеток, которые используют для соответствующих целей биотехнологии.

Для реализации способа используют следующие клеточные культуры:
Vero клетки почки зеленой мартышки;
СПЭВ клетки эмбриона свиньи;
НЕР-2 клетки карцинома гортани человека;
RH клетки почки эмбриона человека.

В качестве стандартного сбалансированного солевого раствора применяют раствор Хенкса, а также среды Игла и 199. В качестве соединений платины используют:
1. Цис-дихлородиамминплатину (П) формулы (1)
PtCl2(NH3)2 (ДДП);
2. Производные платины (П) с полианионом дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) общей формулы (П) [PtCl(NH3)]6(OH)x(H2O)y} n - ДНК-m,
где

n 2000 ± 200;
Соединение 1 при х 0; y 12; m 6n; r 6; поли{гексакис [хлороамминдиакваплатина (П)] μ дезоксирибонуклеат формулы [PtCl(NH3)]6(H2O)12} ДНК-m
где
;
n 1900 ± 90;
m 6n.

Соединение П при x 2; y 10; m 4n; r 4; поли{ бис[гидроксохлорамминакваплатина (П)]-тетракис [хлороамминдиакваплатина (П)] μ дезоксирибонуклеат формулы [PtCl(Nh3)]6(OH)2(H2O)10} n - ДНК-m
где

n 2000±100;
m 4n.

Соединение III при x0; y 6; m 6n; r 6; поли{гексакис[хлороамминакваплатина (П)] μ дезоксирибонуклеат формулы [PtCl(NH3)]6(H2O)6}n ДНК-m,
где

n 2100 ± 100;
m 6n.

Соединения ДДП, 1, II, III представляют собой мелкокристаллические порошки желтого цвета, без запаха, устойчивые на воздухе, способные в течение года храниться без изменения свойств.

Контроль качества готового продукта осуществляли методом проточной цитофлюориметрии после комбинированного окрашивания ядер.

Пример 1. Культуру клеток HEP-2 в посевной концентрации 2•105 кл/мл высевают в стерильные матрасы вместимостью 1,5 л в 150 мл ростовой питательной среды, содержащей 10% сыворотки крови крупного рогатого скота, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 ЕД/мл стрептомицина. Клетки культивируют 24 ч при температуре 37oC и получают клеточную массу, содержащую 7,5•107 клеток. Затем среду роста заменяют равным объемом сбалансированного солевого раствора Хенкса, содержащего 180•10-4 г/дм3 поли{гексакис[хлорамминакваплатины (П)] μ дезоксирибонуклеата (соединение III). Клетки инкубируют в термостате в течение 6 ч при 37 oC. После окончания инкубирования полученная клеточная масса, содержащая 7,5•107 клеток, представляет собой конечный продукт - синхронизированную в GI-фазе монослойную клеточную культуру. Анализ полученного продукта показывает, что 100% клеток находится в GI-фазе цикла, а клетки в S- и G2-M-фазах не обнаружены (табл.2, пример 4).

Пример 2. С целью выяснения влияния сбалансированного солевого раствора на качественный и количественный состав конечного продукта в процессе инкубирования клеток культуры, был осуществлен следующий опыт. Культивирование клеток осуществляют, как в примере 1, с получением 7,5•107 клеток культуры. Затем среду роста заменяют равным объемом сбалансированного солевого раствора Хенкса и клетки инкубируют в термостате в течение 6 ч при 37oC. После окончания инкубирования клеточная масса содержала те же 7,5•107 клеток. Анализ полученного продукта показывает, что 62,60% клеток находится в GI-фазе, 2,7% в S-фазе и 34,70% в G2-M-фазе клеточного цикла (табл.2, пример 35).

Сопоставительный анализ составов конечного продукта, представленных в примере 35 (табл.2) и в примере 1 (табл.1) показывает, что содержание клеток в различных фазах цикла при инкубировании клеток культуры НЕР-2 только в сбалансированном солевом растворе не отличается от такового в интактной суточной культуре (после культивирования).

Пример 3. Культуру клеток НЕР-2 в посевной концентрации 2•105 кл/мл высевают в стерильные матрасы вместимостью 1,5 л в 150 мл ростовой питательной среды, содержащей 10% сыворотки крови крупного рогатого скота, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 ЕД/мл стрептомицина. Клетки культивируют 24 ч при температуре 37oC и получают клеточную массу, содержащую 7,5•107 клеток. Затем среду роста заменяют равным объемом среды Игла, содержащим 53•10-8 г/дм3 цис-дихлородиамминплатины (П) - PtCl2(NH3)2 (ДДП). Клетки инкубируют в термостате в течение 6 ч при 37oC. После окончания инкубирования получают клеточную массу, содержащую 7,5•107 клеток, которая представляет собой конечный продукт синхронизированную в GI-фазе монослойную клеточную культуру. Согласно анализу, конечный продукт содержит 99,50% клеток, находящихся в GI-фазе; 0,5% клеток, находящихся в G2-M-фазе и не обнаружены клетки, находящиеся в S-фазе клеточного цикла (табл.2, пример 16).

Пример 4. Для синхронизации клеток в GI-фазе в суспензии используют культуру клеток Vero. Готовят суспензию клеток Vero в модифицированной среде Игла: из состава среды исключают ионы кальция и магния, и добавляют 10-4 М глицерина, 10-4 М серина, 10-5 М инозита и 10% сыворотки крови крупного рогатого скота. Посевная концентрация - 2•105 клеток в 1 мл. 700 мл полученной суспензии, содержащей 1,4•108 клеток вносят в литровый сосуд (колбу), туда же помещают стерильный магнит и клетки культивируют в термостате при 37oC в течение 24 ч при перемешивании со скоростью 250 об/мин. Получают клеточную массу, содержащую 2,8•108 клеток. Клетки осаждают центрифугированием, суспендируют в 700 мл среды Игла, содержащей 180•10-8 соединения III и инкубируют в термостате в течение 8 ч при 37oC и скорости перемешивания 350 об/мин. Получают конечный продукт 2,8•108 клеток, синхронизированных в GI-фазе (пример 34).

В табл. 2 отражена эффективность предложенного способа синхронизации клеток в GI-фазе клеточного цикла, характеризуемая содержанием в конечном продукте клеток в GI, S- и G2-M-фазах цикла, при проведении инкубирования различного вида клеточной культуры в присутствии различных по химическому строению комплексных соединений платины, используемых как в заявляемом диапазоне концентраций, так и при запредельных их значениях (табл.2, примеры 1 41).

Установлено, что заявляемые соединения платины (PtCl2(NH3)2 и производные платины (П) с полианионом ДНК) используют в концентрациях, обеспечивающих высокую степень синхронизации клеток в культуре в GI-фазе на уровне 95-100% достигаемую при оптимальном времени инкубирования 6 8 ч (табл.2, примеры 1 34).

При снижении концентрации комплексного соединения платины ниже граничного значения, например, соединения III до 4,5•10-4 г/дм3, а ДДП до 2,7•10-8 г/дм3, не обеспечивается регулирование клеточного цикла: содержание клеток в конечном продукте в GI-, S- и G2-M-фазах (примеры 36 и 40, соответственно), соответствует их содержанию в клеточной массе после инкубирования только в сбалансированном солевом растворе (пример 35), или содержанию в интактной суточной культуре после культивирования (табл.1, пример 1).

Верхний предел значений концентраций соединений платины ограничен тем, что дальнейшее ее повышение (например, соединения III до 1350•10-4 г/дм3, а ДДП до 795•10-8 г/дм3) приводит к гибели клеток культуры (примеры 37 и 41, соответственно).

Оптимальными концентрациями соединений платины, обеспечивающими максимальную производительность предложенного способа, т.е. 100%-ную синхронизацию клеток в GI-фазе в конечном продукте, являются для ДДП (106 - 530)•10-8 г/дм3, для соединений I, II, III (180 - 900)•10-4 г/дм3.

Проведение процесса инкубирования клеток в присутствии комплексных соединений платины в заявляемых концентрациях, но в течение времени, менее 6 ч, например, 5 ч, обеспечивает синхронизацию клеток НЕР-2 в GI-фазе всего на 72,55% при этом, 2,7% клеток находятся в S-фазе и 24,75% в G2-M-фазе (пример 38). В этом случае эффективность предложенного способа находится практически на уровне способа-аналога.

Увеличение же времени инкубирования более 8 ч является нецелесообразным, т. к. не приводит к увеличению эффективности синхронизации клеток в GI-фазе (пример 39).

В табл. 3 представлены сопоставительные данные по производительности предложенного способа и способа-аналога, выраженные количеством клеток в GI-фазе в конечном продукте, полученные при их реализации в оптимальных режимах. Как следует из представленных данных, предложенный способ обеспечивает достижение максимальной производительности 100%-ной синхронизации клеток клеточного массива культур в GI-фазе, независимо от вида используемых культур. При этом, достигаемая производительность превышает производительность способа в случае использования культуры Vero в 1,3 раза, культуры НЕР-2 1,60 раза, культуры СПЭВ в 2,5 раза, культуры RH в 5 раз.

Таким образом, основным преимуществом предложенного способа является достижение максимально полной синхронизации клеточной культуры в GI-фазе, независимо от вида клеточной культуры, способа культивирования и объема перерабатываемой клеточной массы, что не достигается ни одним из известных способов. Это приводит к значительному увеличению производительности процесса получения клеток в GI-фазе: при использовании широко применяемых культур клеток Vero, СПЭВ, НЕР-2, RH производительность увеличивается в 1,3 5 раз.

Следует также отметить, что высокая производительность предложенного способа синхронизации клеток в GI-фазе клеточного цикла достигается с использованием простой технологии, не требующей больших затрат энергии, дорогостоящих оборудования и реактивов, что делает предложенный способ технологичным и экономичным.

Похожие патенты RU2088661C1

название год авторы номер документа
ВАКЦИНА РОТАВИРУСНАЯ ИНАКТИВИРОВАННАЯ ДЛЯ ИММУНИЗАЦИИ ЖИВОТНЫХ 1995
  • Дзюблик Ирина Владимировна[Ua]
  • Трохименко Елена Петровна[Ua]
  • Гирин Виталий Николаевич[Ua]
  • Шалимов Сергей Александрович[Ua]
  • Кейсевич Людвиг Владиславович[Ua]
RU2095083C1
КОМПОЗИТ ГЕКСАПЕПТИДА СО СТАБИЛИЗИРОВАННОЙ ДИСУЛЬФИДНОЙ СВЯЗЬЮ С ВЕЩЕСТВОМ МЕТАЛЛОМ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ НА ЕГО ОСНОВЕ, СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ НА ОСНОВЕ РЕГУЛЯЦИИ МЕТАБОЛИЗМА, ПРОЛИФЕРАЦИИ, ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ И МЕХАНИЗМОВ АПОПТОЗА В НОРМАЛЬНЫХ И ПАТОЛОГИЧЕСКИ ИЗМЕНЕННЫХ ТКАНЯХ 1999
  • Кожемякин Л.А.
  • Балазовский М.Б.
RU2153350C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПОЗИТА ОКИСЛЕННОГО ГЛУТАТИОНА С CIS-ДИАМИНОДИХЛОРПЛАТИНОЙ И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ КОМПОЗИЦИЙ НА ЕГО ОСНОВЕ, РЕГУЛИРУЮЩИХ МЕТАБОЛИЗМ, ПРОЛИФЕРАЦИЮ, ДИФФЕРЕНЦИРОВКУ И МЕХАНИЗМЫ АПОПТОЗА НОРМАЛЬНЫХ И ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ КЛЕТОК 1998
  • Балазовский М.Б.
  • Кожемякин Л.А.
RU2144374C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИВИРУСНОГО ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ ДНК 1994
  • Нестерова Е.И.
  • Аносова И.Г.
  • Асафов А.В.
  • Безюлев В.В.
RU2108797C1
ТРЕХЪЯДЕРНЫЕ КАТИОННЫЕ КОМПЛЕКСЫ ПЛАТИНЫ, ПРОЯВЛЯЮЩИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВУЮ АКТИВНОСТЬ, СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ ЭТИ КОМПЛЕКСЫ 1995
  • Мариелла Валсекки
  • Марко Конти
  • Луиза Дель Греко
  • Карло Бугатти
  • Эрнесто Мента
  • Фердинандо Гильяни
  • Карла Манцотти
  • Сильвано Спинелли
  • Николас Фаррелл
RU2130941C1
СРЕДСТВО ДЛЯ РЕГУЛИРОВАНИЯ ЭНДОГЕННОЙ ПРОДУКЦИИ ЦИТОКИНОВ И ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ (ВАРИАНТЫ) И СПОСОБ ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ 1996
  • Балазовский М.Б.
  • Кожемякин Л.А.
RU2153351C2
СРЕДСТВО ДЛЯ ИНГИБИРОВАНИЯ РЕПРОДУКЦИИ ОБОЛОЧЕННЫХ ВИРУСОВ, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ И СПОСОБ ИНГИБИРОВАНИЯ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ 2003
RU2236852C1
Способ получения комплексного соединения платины (II) с высокомолекулярной н-ДНК из селезенки крупного рогатого скота марки А, обладающего противоопухолевой активностью 1988
  • Волченскова Илима Илиодоровна
  • Майданевич Надежда Николаевна
  • Бударин Лев Иванович
  • Трохименко Елена Петровна
  • Кейсевич Людвиг Владиславович
  • Шалимов Сергей Александрович
SU1685944A1
ЛИПОСОМНЫЙ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ ПРЕПАРАТ И ЛЕЧЕБНО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКИЙ КРЕМ НА ЕГО ОСНОВЕ 1995
  • Асафов А.В.
  • Безюлев В.В.
RU2117474C1
ВОДОРАСТВОРИМОЕ СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ПРОТИВОВИРУСНОЙ И ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ, НА ОСНОВЕ СОЕДИНЕНИЯ ИОННОГО СЕРЕБРА С МЕТИЛЕНОВЫМ СИНИМ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ 2008
  • Третьяков Василий Васильевич
  • Сильников Владимир Николаевич
  • Кулагин Валерий Фёдорович
  • Власов Валентин Викторович
  • Рихтер Владимир Александрович
  • Третьякова Ольга Владимировна
  • Тихонов Валерий Лаврентьевич
  • Глотова Татьяна Ивановна
RU2390343C1

Иллюстрации к изобретению RU 2 088 661 C1

Реферат патента 1997 года СПОСОБ СИНХРОНИЗАЦИИ КЛЕТОК В G1-ФАЗЕ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА

Использование: в биотехнологии. Сущность изобретения: синхронизацию клеток в GI-фазе цикла осуществляют путем инкубации выращенных клеток культуры в присутствии PtCl2(NH3)2 или производных платины (II) с полианионом дезоксирибонуклеиновой кислоты. Способ обеспечивает получение 95-100% клеток культур HEP-2, Vero, СПЭВ и RH, синхронизированных в GI-фазе. 1 з.п. ф-лы, 3 табл.

Формула изобретения RU 2 088 661 C1

1. Способ синхронизации клеток в G1-фазе клеточного цикла, включающий выращивание клеток, добавление к выращенным клеткам синхронизирующего агента и дальнейшую инкубацию, отличающийся тем, что в качестве синхронизирующего агента используют цис-дихлордиамминплатины (II) формулы PtCl2(NH3)2 или производные платины (II) с полианионом ДНК общей формулы [PtCl(NH3)]6 (OH)x(H2O)y}n - ДНК-m,
где n 2000 ± 200
при х 0, y 12, m 6n, r 6;
х 2, y 10, m 4n, r 4;
х 0, y 6, m 6n, r 6,
в действующей концентрации.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что цис-дихлордиамминплатину (II) используют в концентрации (5,3 530) • 10-8 г/дм3, а соединения платины (II) с полианионом ДНК в концентрации (9 900) • 10-4 г/дм3.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 1997 года RU2088661C1

Печь для непрерывного получения сернистого натрия 1921
  • Настюков А.М.
  • Настюков К.И.
SU1A1
Cell Separation
Acad
Press London
Очаг для массовой варки пищи, выпечки хлеба и кипячения воды 1921
  • Богач Б.И.
SU4A1
Печь для непрерывного получения сернистого натрия 1921
  • Настюков А.М.
  • Настюков К.И.
SU1A1
Аппарат для очищения воды при помощи химических реактивов 1917
  • Гордон И.Д.
SU2A1
Методы вирусологии и молекулярной биологии
- М.: Мир, 1972, с
Видоизменение пишущей машины для тюркско-арабского шрифта 1923
  • Мадьяров А.
  • Туганов Т.
SU25A1

RU 2 088 661 C1

Авторы

Дзюблик Ирина Владимировна[Ua]

Трохименко Елена Петровна[Ua]

Кейсевич Людвиг Владиславович[Ua]

Даты

1997-08-27Публикация

1995-05-30Подача