"Способ изготовления инактивированной концентрированной эмульгированной вакцины против болезни Ауески (Вакцина "БАК")" Советский патент 1993 года по МПК A61K39/295 

Изобретение относится к ветеринарной вирусолог-ми, в частности к способам изготовления вакцин для специфической профи- лактик и животных

Целью изобретения является разработка способа изготовления инактивированной вакцины против болезни Ауески, обладающей высокой-иммуно1енностью

Предполагаемый способ осуществляется следующим образом

Вирулентные или аттенуированные (вакцинные, маркированные) штаммы вируса болезни Ауески (ВБА) размножают в суспензионной культуре постоянной линии клеток (линия клеток новорожденного хомяка - ВНК-21 линии клеток почки свиней - ППК. СПС СПЭВ и др ) в ферментерах промышленного типа (100-2000 л) с использованием простой среды отечественного производства (ферментативный гидролизат мышечных белков витамины группы В и глютамин-) с 10% сыворотки крупного рогатого скота Клеточн/ю суспензию, содержащую 2,0-3,0 млн клеток в 1 мл, заражают при соотношении 1-10 ТЦДбо на 1 клетку Сбор вируса производят через 30-68 ч. когда гибель пораженных-Бирусом клеток достигает не менее 70%. При этих условиях выращивания ВБА накапливается в титре 8,0-9,0 1дТЦД50/мл. После инактивации ВБА формалином (0,3%, 37°С, 72 часа) культураль- ную жидкость концентрируют в 30 раз (по объему) с помощью полиэтиленгликоля (мм.6000 Д) в гипертоническом растворе NaCI или ультрафильтрацией. В обоих случаях инактивированнуюсуспензию предварительно осветляют сепарированием, отделяют клеточный детрит. С целью освобождения связанного с клетками вирусного антигена фракцию клеточного детрита тщательно измельчают, пропуская дважды через коллоидную мельницу при минимальном зазоре (00) между трущимися поверхностями. При использовании ультрафильтрации концентрируют осветленную жидкость, а затем к полученному концентСЛ

с:

ш

|ГО

к

со

4 СП

со

рагу дпбавляют гомогенизированную фракцию клеточного детрита. В случае концентрирования инактивированного антигена ПЭГ гомогенизированную фракцию клеточного детрита добавляют к осветленной фракции добавляют к осветленной фракции перед концентрированием. К смеси клеточной и бесклеточной фракции добавляют концентрированные стерилизованные ПЭГ (60%) и NaCI (15%). Конечная концентрация ПЭГ должна составлять 10%, a NaCI - 1,5%. Суспензии тщательно перемешивают и оставляют для агрегации антигена на 16-18 ч при 2-6°С, а затем его осаждают сепарированием. К осадку антигена добавляют забу- ференный (1/15М) физиологический раствор, содержащий 0,3% формалина с таким расчетом, чтобы конечный объем составил 1:30 обьема исходной вируссодержащей культуральной жидкости.

К антигену В Б А, сконцентрированному в 30 раз (ультрафильтрацией или ПЭГ), добавляют стерильный масляный адъювант, состоящий из минерального масла ПЭС-3 (полиэтиленсилоксановая жидкость) 82- 84% и безводного ланолина 166-18% (по объему). На 1 ч. антигена берут 1,5-2 ч. (по объему) масляного адъюванта. Смесь анти- тена ВБА с минеральным адъювантом тща- тельно эмульгируют (при температуре 20-25°С) до образования стойкой гомогенной эмульсии. Эмульгирование проводят с помощью коллоидной мельницы или гомогенизатора промышленного типа, смонтированного в металлическом реакторе или ультразвукового эмульсора.

В табл.1 показано накопление ВБА в различных культуральных системах: в первичной культуре клеток почки свиньи (ПС), в суспензии клеток трипсинизированной ткани куриных эмбрионов (КЭ), в суспензии постоянных линий клеток новорожденного хомяка (линия ВНК-21) и почки свиней (линия ППК).

Из ВБА, выращенного в различных культурах, готовили образцы инактивированной формалином (0,3%) ГОА - сапонин-вакцины. Кроликам вакцину вводили внутримышечно двукратно по 5 мл с интервалом 2 недели. Контрольное заражение кроликов (50 ТЦДьо) проводили спустя 30 дней после начала иммунизации.

Числитель - количество иммунных, знаменатель - количество зараженных животных.

Изданных табл.1 видно, что накопление вируса и иммуногенность вакцины были более высокими в случае использования для его выращивания суспензий перевиваемых клеток (ВНК-21 и ППК)

В табл.2 показано накопление и иммуногенность двух производственных штаммов К и БУК-668 ВБА. Вирулентный штамм К используют в биопромышленности для изготовления инактивированной вакцины (Ар- мНИИ животноводства и ветеринарии), а аттенуированный штамм БУК-668 применяли в производстве живой вакцины для сельскохозяйственных животных. Оба штамма

вируса размножали в суспензии клеток постоянной линии ППК. Из вируса готовили инактивированную формалином эмульгированную вакцину. Иммуногенность вакцины сравнивали на морских свинках (масса 300400 г), которых прививали подкожно в дозе 1 мл и заражали вирулентным штаммом К

ВБА (10Г20 ЛДюо АЛЯ м.свинок) спустя 21 день.

Из данных табл.2 видно, что по накоплению в суспензионной культуре клеток ППК и иммуногенности аттенуированный и вирулентный штаммы ВБА не различались между собой.

В табл.3 приведены данные о целесообразности использования клеточного детрита после размножения ВБА в суспензионной культуре клеток в качестве дополнительного источника вирусного антигена при изготовлении инактивированной

вакцины. После максимального накопления ВБА в суспензионной культуре клеток ВНК- 21 вируссодержащую суспензию разделили на 2 ч. Из одной с помощью центрифугирования удаляли клеточный детрит, другую оставляли без обработки. Из обеих частей вирусной суспензии готовили инактивированную эмульгированную вакцину, иммуногенность которой испытывали на морских свинках, как описано выше.

в табл.4 приведены данные по значению степени концентрирования инактивированного ВБА на иммуногенность вакцины.

Инактивированный вирусный антиген

концентрировали в 5, 10, 30, 40 и 100 раз с помощью полиэтиленгликоля (молекулярная масса 6000 Д) или ультрафильтрацией через полые волокна или мембранные фильтры, задерживающие молекулы массой

15000Д диаметр пор S 10 нм). Перед концентрированием антигена ультрафильтрацией культуральную жидкость осветляли осаждая клеточный детрит сепарированием. После концентрирования к ультрафильтрату добавляли клеточный детрит, предварительно измельченный на коллоидной мельнице. При концентрировании антигена полиэтиленгликолем в гипертоническом растворе NaCI (конечная концентрация соответственно 10% и 2,3%)

обрабатывали неосветленную культураль- ную жидкость. К концентрированным двумя методами антигенам добавляли масляный адъювант. Иммуногенность инактивирован- ной вакцины с различным содержанием инактивированного антигена ВБА сравнивали на м. свинках, которым вакцину вводили внутрикожно в дозе 0,1 мл.

Из данных таблицы видно, что способ концентрирования вирусного антигена не влиял на иммуногенность вакцины. С увеличением степени концентрирования антигена возрастала иммуногенность вакцины. После концентрирования антигена в 30 раз вакцина в дозе 0,1 мл защищала 90% животных от заболевания и гибели при экспериментальном заражении. Все контрольные животные погибли. Дальнейшее увеличение степени концентрирования вирусного антигена или не дало повышения иммуцргенно- сти вакцины (концентрирование в 40 раз), или снижало ее иммуногенность и вместе с тем затрудняло технологию изготовления препарата.

В табл. 5 приведены данные по сравнению эффективности применения различных адъювантов для усиления иммуногенности различных адъювантов для усиления иммуногенности инактированной вакцины. В качестве адъювантов использовали гидрат окиси алюминия (ГОД) и масляный адъювант (минеральное масло ПЭС-3-84% и ланолин - 16%). Указанные адъюванты добавляли к инактивированому концентрированному в 30 раз антигену ВБА соответственно 15% (ГОД) и 60% (масляный адъювант). В последнем случае смесь гомогенизировали (8000 об/мин, 30 сек) до получения стойкой эмульсии (вода в масле) Иммуногенность вакцин без адъюванта, с ГОД и масляным адъюван- том сравнивали на морских свинках, привитых внутрикожно в дозе 0,1 мл.

Из данных табл. 5 видно, что добавление адъюванта значительно повышает иммуногенность инактивированной вакцины. Наиболее напряженный иммунитет создается при использовании эмульгированного препарата, в состав которого входит минеральное масло.

В табл. 6 представлены данные об изменении иммуногенных свойств инактивированнойконцентрированнойэмульгированной вакцины в процессе ее хранения при 2-6°С в течение 18 месяцев. Иммуногенность препарата проверяли на морских свинках сразу после изготовления и через 6, 12, 18 месяцев хранения. Морских свинок вакцинировпли внутрикожно s дозе 0.1 мл

Данные табл.6 свидетельствуют о высокой стабильности иммуногенных свойств инактивированной концентрированной эмульгированной вакцины в процессе хра- 5 нения при 2-6°С. Специфическая активность препарата практически не изменилась в течение 18 мес хранения (срок наблюдения).

В табл.7 приведены результаты срав- Ю нительного испытания иммуногенности трех вакцин на морских свинках: 1) вакцина, приготовленная на Ставропольской биофабрике по методу Армянского НИИ живо- тновбдства и ветеринарии; вакцина, 5 приготовленная фирмой Рон-Мерье (вакцина Geskypur) и 3) инактивированная концентрированная эмульгированная вакцина, изготовленная по предлагаемому нами способу (вакцина БАК). Каждой вакциной при- 0 вивали морских свинок двумя способами подкожно в дозе 1 мл и внутрикожно в дозе 0,1 мл. Контрольное заражение проводили через 21 день одновременно с невакцинированными животными.

5Результаты этого исследования (табл.7)

показали, что вакцина БАК обладает более выраженной иммуногенностью по сравнению с двумя другими при обоих способах вакцинации.

0 Разница в иммуногенности препаратов особенно отчетливо проявилась при внутри- кожном способе введения вакцины в небольшой дозе (0,1 мл). Так, например, вакцина БАК. защищала 90% животных, тог- 5 да как вакцина фирмы Рон-Мерье и АрмНИ- ИЖиВ соответственно 50% и 10% привитых животных. Аналогичные данные получены при комиссионном сравнительном испытании трех указанных вакцин на норках и пес- 0 цах в совхозе Родники Московской области.

По предлагаемому способу была изготовлена на Армавирской биофабрике опытно-промышленная серия вакцины БАК в 5 количестве 340 л, Иммуногенность вакцины проверяли на овцах и морских свинках. Овец прививали внутримышечно в дозе 1,0 мл. морских свинок подкожно в дозе 1,0 мл. Контрольное заражение проводили виру- 0 лентным штаммом ВБА через 21 день. Все вакцинированные морские свинки (24 головы) и овцы (3 головы) оказались иммунными, а все контрольные морские свинки (10 голов) и овцы (2 головы) заболели и погибли от 5 болезни Ауески через 6-8 дней после заражения. Указанная серия вакцины БАК полностью соответствовала требованиям ТУ (10.09 114-91 г., утверждены ГУВ МСХ СССР 27.05.91 г.) и выпущена для использования в ветеринаоной практике.

Инактивированная концентрированная эмульгированная вакцина против болезни Ауески (вакцина БАК), приготовленная по предлагаемому способу, имеет следующий состав:

1.Антиген

Инактивированный, концентрированный в 10-30 раз 35:40%

2.Масляный адьюеант

Минеральное масло 82-84% 60т65%

Ланолин 18-16%

Формула изобретения

1. Способ изготовления инактивирован- ной концентрированной эмульгированной вак цины против болезни Ауески, включаю- щИй размножение вируса болезни Ауески в культуре клеток, его инактивацию, концентрирование культуральной жидкости, ее смешивание с адьювантом. о т л-и чающий- с я тем, что вирус размножают в суспензи- онной культуре постоянной линии клеток с

концентрацией 2-3 млн клеток в 1 мл и множественностью заражения 1-10 ТЦДбо/клетка, до титра 8-9 и до разрушения не менее 70% клеток, инактивацию проводят 0,3%-ным формалином при 37°С в тече- ние 72 ч, концентрирование в 10-30 раз Проводят ультрафильтрацией, используя фильтрующие элементы, задерживающие молекулы массой 15000 Д, или полиэти- ленгликолем с мол.м. 6000 Д в конечной концентрации 9-10% в присутствии 2,3%- ного NaCI, из адъювантов используют масляный адъювант, а смешивание с вирусом осуществляют в соотношении 1:1,5-2.0.

2. Способ по п.1.отличающийся тем. что перед концентрированием ультрафильтрацией клеточный детрит отделяют от жидкости сепарированием, гомогенизируют на коллоидной мельнице и объединяют с ультрафильтратом.

Использование ветеринарная вирусология. Сущность изобретения: вирус, размноженный в суспензионной культуре клеток до титра 8,0-9,0 Ig ТЦДбО/мл, инак тивируют формалином, концентрируют в 10- 30 раз ультрафильтрацией или полиэтиленгликолем, добавляют масляный адъювант в соотношении 1.1,5-1 2 и смешивают до образования стойкой эмульсии

Таблица Накопление ВБА в различных культурах клеток и его иммуногенные свойства

Примечай ие: Числитель-количество иммунных, знаменатель-количество зараженных животных.

Таблица Накопление в культуре и иммуногенность двух штаммов ВБА

Примечание. Числитель - количество иммунных, знаменатель - количество зараженных животных.

Таблица 3

Иммуногенность инактивированной вакцины приготовленной из осветленного и неосветленного культурального ВБА

Накопление вируса в культуре кпеток ВНК-21

Культуральный вирус для из/отовления вакцины

8,0 Ig ТЦДю/мл Контроль

без клеточного детрита с клеточным детритом

Примечание: Числитель - количество иммунных, знаменатель - количество зараженных животных.

Таблица 4

Влияние способа и степени концентрирования антигена ВБА на иммуногенность инактивированной вакцины

Примечание: Числитель - количество иммунных, знаменатель - количество зараженных животных.

Влияние адъюванта на иммуногенность вакцины

Характеристика вирусного сырья

ВБА размножен в суспензии

клеток ВНК-21 ( 8,0 Ig ТЦД50/мл) Инактивирован- ный антиген сконцентрирован ультрафильтрацией в 30 раз

Иммуногенность инактивированной вакцины для м. свинок

11/15

15/15,

0/5

Таблицаб

Адъювант

Иммуногенность для морских свинок

2/10

4/10 10/10

Примечание: Числитель - количество иммунных, знаменатель - количество зараженных животных.

Таблицаб Изменения иммуногенности эмульгированной вакцины в процессе хранения

Примечание: Числитель - количество иммунных, знаменатель - количество зараженных животных.

Результаты сравнительной оценки иммуногенности различных вакцин на морских свинках

Продолжение табл. 5

Таблица