Способ приготовления подложки для культивирования клеток заднего эпителия роговицы глаза Советский патент 1993 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к медицине и преимущественно может быть использовано в офтальмологии, в частности для получения сплошного монослоя клеток заднего эпителия In vitro на подложке для его последней трансплантации In vivo при различной патологии роговой оболочки глаза.

Целью изобретения является упрощение и ускорение процесса приготовления подложки путем замены используемого в прототипе глутарового альдегида соединением М.М.М .М-тетраизопропоксиметилдиа- мида малоновой кислоты

Для достижения поставленной цели в 3%-ный водный раствор желатины (ПО Свема. Шостка) вводится 0,5-0,9 х 10 М N.N.N N -тетраизопропоксиметилдиамида

малоновой кислоты (в виде 1 %-ного водного растворч) на 1 г воздушно-сухого желатина. Пример 1. Готовится 3%-ный водный раствор желатины в который вводится 0,5 х 10 М N.N.N .N1-тетраизопропоксиметилдиамида малоновой кислоты Из этого раствора, поддерживаемого при 30°С пленки-подложки готовятся так же, как и в прототипе, т.е в отверстии миллипорового фильтра Желатиновые подложки сушатся при температуре 20°С и относительной влажности 65% в течение 35-40 мин После промывания в 2 сменах физиологического раствора и в растворе питательной среды по 15 мин пленки укладываются на дно лунок пластикового планшета, куда вводится суспензия клеток заднего эпителия роговицы

00

го ю

00

о

глаза кролика плотностью 500 кл/мл. Инкубация в термостате при температуре 37°С в атмосфере увлажненного воздуха в 5% С02. Используемая среда: ДМЕМ (Dulbecco s modlaied Eagle medium) с 15% фетальной сыворотки крупного рогатого скота и смесью антибиотиков. Через 48 ч культивирования 1 /3 площади подложки была заполнена активно растущими клетками, форма и размер которых характеризовались выраженным полиморфизмом. Однако было отмечено, что вся поверхность подложки пронизана множеством складок,что по нашему мнению, является результатом недостаточной концентрации структурирующего агента (дубителя), На 5-6 сутки культивирования клетками было покрыто 2/3 площади подложки, а на 10-11 сутки культура достигла конфлюентного состояния. Клетки приоб- релиформунеправильных

шестиугольников, но плотного прилегания клеток друг к другу не наблюдалось из-за складчатости подложки.

Таким образом, общее время приготовления подложки составляет 80-85 мин.

Пример 2. Готовится 3%-ный водный раствор желатины, в который вводится 0,7 х М N,N.N ,N -тетраизопропоксиметилди- лмида малоновой кислоты. Пленки готовятся аналогично примеру 1, но в отличие от него высыхают на 5-10 мин скорее, т.е. в течение 30-35 мин. После промывания в 2 сменах физиологического раствора и в растворе питательной среды по 15 мин пленки использовались в качестве подложки для культипирования клеток заднего эпителия роговицы глаза кролика, Через 48 ч культивирования 1/3 площади подложки была заполнена распластанными и активно растущими клетками, форма и размер которых также характеризовались выраженным полиморфизмом; подложка выглядела гладкой и равномерно растянутой на всем протяжении. На 5-6 сутки культивирования клетками было покрыто 2/3 площади подложки. Большинство клеток сохраняло от- росчатую форму, но их полиморфизм был менее выражен. На 7-8 сутки культивирования культура достигла конфлюентного состояния: клетки приобретали шестигранную форму и плотно прилегали друг к другу.

Общее время приготовления подложки составляет 75-80 мин.

Пример 3 Готовится 3%-ный водный раствор желатины, в который вводится 0.9 хЮ М N.N.N .N-тетраизопропоксиметил- диамида малоновой кислоты Пленки готовятся аналогично примеру 2, но высыхают они на 5-10 мин скорее т е. а течение 25 30 мин После промывания в 2 сменах филио

логического раствора и в растворе питательной среды по 15 мин пленки использовались в качестве подложки для культизирования клеток заднего эпителия роговицы глаза

кролика. Состояние подложки, а также динамика роста клеток и скорость образования монослоя аналогичны примеру 2, однако морфология клеток резко отличалась. Культура характеризовалась резко

выраженным полиморфизмом и по достижению конфлюентного состояния, а в некоторыхклеткахвыявлялисьцитоплазматические вакуоли, что свидетельствовало о некоторой токсичности лодложки.

Общее время приготовления подложки составляет мин.

Таким образом, существенным отличием предлагаемого изобретения является замена используемого в прототипе глутарового альдегида на формальдегидный дубитель N.N.N , -тетраизопропоксиме- тилдизмид малоновой кислоты, обладающий меньшей восстановительной

активностью, чем глутаральдегид. Подобное решение задачи является оригинальным и не вытекает из известного уровня знаний, поскольку N,N,N; ,N( -тетраизопропоксиме- тиламид малоновой кислоты использован в

совершенно отличной от медицины сфере, а именно в качестве дубителя в производстве фотопленок в концентрации 1x10 М на 1г воздушно-сухого желатина.

Использование заявляемого способа

позволяет упростить и ускорить процесс приготовления желатиновой подложки для культивирования клеток заднего эпителия роговицы для их последующей трансплантации In vivo более чем в 10 раз (см.таблицу).

Выбранная концентрация дубителя отО,5до 0,9 х 10 М является оптимальной, что подтверждается результатами экспериментов, представленных в таблице.

Формула изобретения

Способ приготовления подложки для

культивирования клеток заднего эпителия роговицы глаза, включающий погружение имеющего отверстие миллипорового фильтра в 3%-ныЈ. водный раствор желатины при

температуре 30°С, введение сшивающего агента с последующим высушиванием при 20°С и относительной влажности 65%, о т - личающийся тем, что, с целью упрощения и ускорения приготовления подложки, в

качестве сшивающего агента используют 05-0,9 х М N.N.N .N тетраизопропок- симетилдиамида малоноьой кислоты, кото рык вводят в виде 1% но го водного раствора.

Характеристика предлагаемого и прототилного с otofloa.

Использование: биотехнология, медицина В 3%-ный водный раствор желатины вводят N.N.N1 ,Nf -тетраизопропоксиметил- диамид малоновой кислоты (в виде 1 %-ного водного раствора) до конечной концентрации 0,9 х М. Приготовление пленок-подложек в отверстии миллипорового фильтра осуществляют путем погружения его вЗ %- ный водный раствор желатины, затем сушат при температуре 20°С и относительной влажности 65% в течение 30 мин Способ позволяет упростить и ускорить процесс приготовления желатиновых подложек для культивирования клеток заднего эпителия роговицы глаза и их последующей трансплантации 1 табл &