Способ микроразмножения женьшеня Советский патент 1993 года по МПК A01H4/00 

w

Ё

Использование: сельское хозяйство и биотехнология, в частности в селекции и семеноводстве женьшеня. Сущность изобретения: микроклональное размножение женьшеня осуществляют путем вычленения цветочных бутонов из соцветий, индуцированных предварительно при культивировании спящих почек корневища на питательной среде Мурасиге - Скуга, содержащей в своем составе 0,5 мг/л 6-БАП и 0,5 мг/л ГКз. Цветочные бутоны высаживают на питательную среду и культивируют до получения зрелых эмбриоидов. которые пересаживают на питательную среду Мурасиге - Скуга для индукции побега - и корнеобразо- вания, содержащую половинное количество макроэлементов и дополнительно 4,0 мг/л 6-БАП и 0,5 мг/л ГКз. 4 табл.

Изобретение относится к сельскому хозяйству и биотехнологии, в частности к селекции и семеноводству женьшеня.

Целью изобретения является ускорение процесса размножения и круглогодичное получение бутонов.

Сущность предлагаемого способа со стоит в том, что в способе клональногомик- рораэмножения женьшеня настоящего, включающего вычленение из соцветий бутонов, посадку их на питательную среду Мура- сиге-Скуга, содержащую МНзМОз, KNOg. CaCl2 2H20, MgS04 7H20, КН2Р04, KI, НзВОз, MnS04 4H20, ZnS04 7H20. NaMoO 2Н20, CuS04-5H20, CoCI2 6H20, FeS04 7Н20 Na2EDTA 2H20 инозитол, никотиновую кислоту, пироксидин HCI. тиамин HCI, глицин, сахарозу и воду с добавлением 1,0 мг/л 2,4- Д. культивирование до образования эмбри- огенных каллусов субкультивирование их

на среде Мурасиге-Скуга с добавлением вместо 2.4Д, 2,5 мг/л 6-БАП и 2,0 мг/л AHV до образования зрелых эмбриоидов, формирование из них укорененных побегов с последующей высадкой в твердый субстрат, бутоны вычленяют из зачатков соцветий, полученных предварительной выгонкой изолированной покоящейся почки корневища маточного растения на среде Мурасиге- Скуга с добавлением 0,25-0,75 мг/л 6-БАП и 0.025-0,75 мг/л ГКз. а формирование укорененных побегов осуществляют на модифицированной питательной среде Мурасиге-Скуга. в которой концентрация NH4N03, КМОз. CaCl2 2H20, MgS04-7H20. КН2Р04 и сахарозы уменьшена вдвое, а в качестве регуляторов роста добавлены 0.05 мг/л ГКз и 3,5-4,5 мг/л - 6БАП.

Осуществляют способ следующим образом.

00

ю

4

-N

Ичг кмруюг покочщ PO к k ipiipi s MjavH Г вачгз1 , otfi i

МОИ ИОД П И1Я1РМ ПОДОП (ТО ПО Д МО И

обрабатывают 0 2% раслгюоом диицидл течение 10 мину латемтринды промывают стерильном водой У це in |1ицигчшг ншх почек удаляют наружные пог-роиние чв |ум и остатки ткани корневища Подготовлен ные почки помещают в культурап нис сосу ды на проавтоклавироознную ин щиальную среду Инициальная среда для впут рипочеч ною росла содержит кроме с СПОЕННОЙ среды Мурасиге-Скуга 0 25 0 75 мг/л ЬЛП и 0,25-0 75 мг/л I Уз На отои среде ь течение 1 5 мес культивирования на свету пои температуре 20°С и относительной елзх J0(,ut воздуха 40% происхоаит и меиенч., ркрч ски покропных почечных чешуи гмскрьние чешуи и выход р.леного побега состсищого из одного дистя, стеОлч зачагка соцьетил

Побег из культурэ/ibHO о j -уда ксг.ти чески переносят г ч.эии П г т, 1 От , отделяют соцветие и из него ci «oi L дельные бутоны Пледпо зеленой ки размером до I мм в На дни Ly тон, нредв зрительно сдсшив для уьсл/ енмя раневой поверхности, высуни., ют ь куп iy

Р UlbHUll COi уД I I ( ИИ( ПИ ; ТП,

чую рел-. нэ i t i с 2 г (

иЬр З/ОТОи л if рИОГ«- Ю и И I-/i, Т ( ,

,ч| 0|ИС Г ОМ IU1 rt i I, tf / .., i A ,j О i к1

v /r iPp yi

н i ь it Mt i г и тем i e i л i о п т и т- т

l04njlPf 1f ОП;

u и i ) у i ч с

,jKJjT I V ч Я К

I фСДОЛ 1° ( U т 1 Ky/lbTHBt OP Э|1 I 1

шеподибн ю ом риондн lenpi Fi ,r

Ом(ЭрИОГ HI К Ul/iyi I fpf tl lil JIOi Hd pOt „РгмУ -1 lb 11UI 0 uTQtrM

ния мбриоидог мс , ригие nuMuBiiC 1 питпте/ь ион i ред11 ги/л 6 ЬЛП и 2 0 мг/л Л1 / При к/л. nil p ч, ни. на этой срг- др на uieiy три 20;С и относит льнии члах Bojnv.a

70% npOVU, (. /,ИТ агы i UId Дг ффорОНЦИ

эция jM6pnonflHbix ь yi rvp и (рез 1 культивирования образуется омириогеннии каллус од ржащии иелм( эмориоицы Зрелые jM6pi оиды neper оживают на реге нерационную питпельнук; ;реду ф|Д O/IHO временного г онумения JP и мх укоренение Эт) срела го тоит из ULH -июи

МурЗСИГС ( Ку(1 Р КОЮРОИ (.

рация NH.iNCh Сс С1г- Н:О . v(- 2fOi r i ax T)t 0| /M°HI tin 1Д -ос1 05 MI л K и ч гт л. /л г,

о

5

0

5

)

II э ии сред ТРЧС.НЧ 1 rue упьти V IK тш г MJ эмбрион; i нормируете по ЧР (к т которой рлзвиптртся нормальные рогтрния имеки д но i opent и с одним или несколькими тистьг1 1И

Panemiq извлекают и} к пьт/ральных сг-оудон и вь1с.ажипают дня адаптации в вермикулит пропитанный питательной средой Mypacni e Скуга

Пример В совхозе женьшень Приморского края были отобр анм элитные корни женьшеня настоящего 5 лечнег) возраста с хорсик оазвитыми покоящими почками

Почки изолировали Каждую из них дважды , in мыльной водой затем- подопритоднои 1глгывали 02%-м рэс- тиором диии 1ДсЗ м 10 минут Затем п o 1ЫDг н ггеришгюп водой У щмронтш мх почп( наруж иые покропные i лиуи и Ttann кор- Н(ви11,«ч Для чь Оора концентрации

i jp( tJ pnCI I ОД I/ Ml IX ДЛЯ ИНИЦИ

ации torj jujcTa почки разде лили HJ группы о 10 шт в каждой О дольние почки ич юждог ip/ппы помещали L и тура 1ынIP среды о которые на- проавто лаьированнои fti i л pi д t lOAPpxj с/, Г j х о-С ;га

v Г ilLIT И (. ОТМО I Ь

rtr , i

r

l1

Н СП Л И li1 1 Л V/I

i I 1Л I M 11 i 1 . ДНО Н , J

(i Г 1, ЛП ч

iU Г Ч1НЦ( iTpdll

I j1 ( 1 i Н

Г Иi Я Н iГ)И

((1П I

/i IK ; i i я пр ПО ii

И 11 ) id

ГШ Г у ТО ilpli ПО ТОМ

т.рпции ii L Ь ч /п i и ченя. HIH н цен гPJL i и и TiAt i

iec 1цев к мпературо i воздуха .н ходиьши

v и к (рнеппщ

прсдг-ri nunHii в not имейся вели инициация

ы приводящая к развитию

n icI ов и ГлюДс)Т „я при 0 25

n j iMTciv, lu emn происходит

5

iipi бин t1 г СОК1У он 1гацичх б нииконцч траци 075мг/ i iaf илизир/ет с i i ил i iewTo нныи ы лод нормально разви- ых Р днчко при i онцентрэции С ( ,ем О гг MI /i в рттпитии побе гов наблюдается SM мамш (noOf in с урод л ив и ми лиги им и и /и л и тачатками .оиретии I, ипо/1ьшии выход нормально ризвить х ncne Oi с Зг) соцветий на Олюдаетоя ри 0 5 MI//I 6 БАП

При постоянной концентрации 6 БАП О 5 мг/л и ИЗМЬН.ОЩРИС. я велич г концен грации iK h dfi i-o piMinrii нормаль

НЫХ | ЛЧИН КЧН Он рщИИ ГК(

П JFJ мг/л lips. i мi и i i ii e л 75 тл| // N в , i i HI fit ндают я

зноматии (вытягивание и ослабление) при стабильном количественном выходе. Оптимальное сочетание в инициальной среде определяется: 6 -БАП и ГКз по 0,5 мг/л. Всего на этих вариантах инициальных питатель- ных сред было получено 39 хорошо развитых зеленых побегов, состоящих из одного листа стебля и зачатка соцветия. Далее побеги из культуральных сосудов асептически перенесли в чашки Петри. Отделили от по- бегов соцветия. Из соцветий вычленили отдельные бутоны бледнс еленой окраски размером до 1 мм в диаметре, Для индукции самотического эмбриогенеза использовали бутоны, полученные от побегов иницииро- ванных на средах с разным содержанием 6-БАП и Гкз. Критерием для отбора бутонов служило их нормальное развитие.

Каждый бутон-эксптнт. предварительно сдавив пинцетом для увеличения раневой по- зерхности. высаживали в культуральные сосуды-пробирки дополненные 10 мл индукционной питательной среды, содержащей кроме основной питательной среды Мурасиге-Скуга 1,0 мг/л 24 дихлорфенок- сиуксусной кислоты (2,4Д) (табл 1) Култиви- рованиэ проводили R темноте при

тем,е|

,е 20° и or носи гельнсй влажности 70% Через 20% ит Игчи.та к/лавирования nr.MCTi O У t 0 X экста то наблюдали обрлзоалние каллуса Образ 1 чршиеся на бутонах каллусу олчогл гсльно мягкую консиг.гп-щию светло-жечтои окраски. В этот период они еще не имели типичных признаков эмбрпогенсои тканч (бечый цвет, блеск, повышенняя плотность). Через 2 месяца культивирования примерно 57% каллусов содержало зародышеподобные структуры.

Полученные в результате культивирова- ния на индукционной питательной среде, эмбриоге шые каллусы переносили в куль- туоальные сосуды с 15 УЛ ростовой среды, содержащей кроме основной питательной среды Мурасиге-Ск/га 2,5 мг/л - 6-БАП и 2.0 мг/л АНУ(табл.1) Культивкрорание проводили на свету при температуре 20°С и относительной влажности возд/ха 70%. Через 1 месяц сформировала пмбриогенные каллусы, содер ащие преимущественно зрелые эмбриоиды

Дня формировтния /корененных побегов зрелые эмбриоиды переносили в культура тьные сосуды объемом 50 мл. в которые напивали по 20 -1л генерационной пита- тельной среды СыОп 1 годт) гзщей модифицированную среду Мурэсиге-Скуга с уменьшенным вдвое содержанием . KN03, CsCl2 2H20, MgSo4 7H20. КН2РО и сахарозы (табл.1) и различные концентрации 6-БАП и ГКз (табл.3). Культивирование проводили на свету при температуре 20°С и относительной влажности воздуха 70%. В течение 1 месяца наблюдали изменения происходившие с эмбриоидами на разных вариантах регенерационной среды.

На средах во всех вариантах происходила пролиферация, но только в узком интервале концентраций БАП и ГКз наблюдалось формирование почечки, из которой раэвива- .лись нормальные растения. При этом изменение концентрации 6-БАП выше или ниже оптимального значения 4,0 мг/л при концентрации ГКз 0,5 мг/л приводит к значи- тельномуснижениювыхода

растений-регенерантов. Регенеранты полученные при соотношении 6-БАП 0,5 мг/л и 4 0 мг/л ГКз выглядели очень ослабленными и вскоре погибли. То же и при 6-БАП-О, ГН-1,0 мг/л.

Растения извлекали из культуральных сосудов и высаживали для адаптации в вер- MHKV/IHT пропитанный питательной средой Мураси О Скуга При этом приживаемость растении составляет до 100%

В дополнение к преимуществам предлагаемого способа, изложенным в материалах заявки, приводятся сравнительные данные по длительности этапов клонального микроразмножения женьшеня,

Формула изобретения Способ микроразмножения женьшеня,. включающий вычленение цветочных бутонов, культивирование их на питательной среде до образования зрелых эмбриоидов. пересадку их на питательную среду для получения побегов и их последующего укорене- ния,высадкуполученных

растений-регенерантов на твердый субстрат, отличающийся тем, что цветочные бутоны вычленяют из соцветий, индуцированных предварительно при культивировании спящих почек корневища на питательной среде Мурасиге-Скуга, содержащей в своем составе 0,5 мг/л 6-БАП и 0,5 мг/л ГКз, а для получения укорененных растений-регенерантов эмбриоиды пересаживают на питательную среду Мурасиге-Скуга с половинным содержанием макроэлементов допопнительно - 4.0 мг/л 6-БАП и 0,5 мг/л ГКз

Влияние концентрации 6-БАП и ГКз на инициацию внутрипочечного роста

Таблица 1

Та бл и ца2

Влияние различных концентраций БАП и ГКл на развитие эмбриоида

10 П Ы

Выгонка покоящейся почки Получение эбриогенчого каллуса Получение зрелых эмбриоидов Получение побегов Молочение укореннемных юбагов

я б л и ц а 3

Таблица 4