Способ получения растений винограда Советский патент 1991 года по МПК C12N5/04 A01H4/00 

Изобретение относится.к биотехнологии и может быть использовано в селекции и генетике растений винограда.

Цель изобретения - повышение выхода генетически измененных форм растений.

Способ состоит в том, что на первом этапе осуществляют получение каллуса из эксплантатов междоузлий растений, выращенных in vitro, на модифицированной среде Мурасиге и Скуга, содержащей фитогормоны 2,4-Д (2,4-ди- хлорфеноксиуксусная кислота) и БАЛ (Б-6-бензиламинопурин), а на втором - перенос каллуса на модифицированную среду Мурасиге и Скуга, содержащую .фитогормоны БАЛ в концентрации 1 мг/л и НУК (Н-1-нафтилуксусная кислота), культивирование его до появления эм- бриоидов, пересаживание эмбриоидов на упрощенную среду и формирование из них растений согласно изобретению, при этом концентрацию фитогормонов

выдерживают на первом этапе: 2,4-Д равной или большей 2 мг/л и БАЛ, отличную от сертоспецифичного для исследуемого генотипа значений БАЛк, а на втором этапе - концентрацию НУК, равную сортоспецифичному для исследуемого генотипа значению НУКк при этом значения БАПк и НУКк определяют пробным получением эмбриоидов в два этапа на модифицированных средах Мурасиге и Скуга, содержащих на первом этапе 2,4-Д в концентрации 1 мг/л и БАЛ в различных концентрациях, а на втором - БАЛ в концентрации 1 мг/л и НУК в различных концентрациях и с последующим фиксированием сочетаний значений БАПк и НУКк, при которых на средах получаются эмбриоиды. Каллус получают также из листьев растений, при этом на втором этапе выращивания, а также на втором этапе пробного получения эмбриоидов выдерживают концентрацию БАЛ 5 мг/л.

(Л

с&

S

00 CD

Пример 1. Исходным материапом служат растения, выращенные in vitro на упрощенной среде МНР (1/4 макроэлементы, микроэлементы и Fe-хеллат - по Мурлсиге и Скугу, ионотит 100 мг/л тиамин 5 мл/л, пиридоксин 5 мг/л, никотиновая кислота 0,5 мг/л гумат натрия 30 мг/л, сахароза 3%, агар 0,8%), сорта Подарок Магарача. Для получения клллуса эксплантаты междоузлий и целые листья, разрезанные пополам перпендикулярно центральной жилке, помещают на модифицированную среду Мураснге и.Скуга, содержащую фитогормоны 2,4-Д в концентрации 1 мг/л и БАЛ (1БЛП) в различных концентрациях с шагом 0,4 мг/л, и культивируют их в стаканчиках объемом

каллуса из междоучлий, или 2 IJATI 5 MI /л в случае каллуса из листьев. Для получения растений эмОриоиды переносят в стаканчики на реду МНР, выдерживают в холодильнике четыре недели при 4 С и затем продолжают культивировать в помещении с освещением 2000-3000 лк (лампы ДЧ-40) при 16 ч светопериоде и температуре 25 - 27°С.

У 70% полученных растений обнаружены отклонения по количеству семядолей вплоть до их отсутствия, 85% семядолей с нарушениями генетического характера, десЬормированы. В зависимости от используемой концентрации 1 БАЛ установлены различные нарушения дифференцированных листьев и апикаль

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в селекции и генетике растений винограда. Целью изобретения является повышение выхода генетически измененных форм растений. Способ заключается в получении большого количества растительного материала путем соматического эмбриогенеза. При этом различными комбинациями вносимых в среду фитогормонов достигается расширение спектра изменчивости растений. 2 табл.

150 мл, содержащих по 20 мл питатель- JQ ного доминирования, изменение формы

П . г

25

35

ной среды, в темноте при 28UC (первый этап). МодисЬикация среды заключается в удалении гидролизата казеина и увеличении концентрации витаминов (тиамин 10 мг/л, пиридоксин 1 мг/л, никотиновая кислота 5 мг/л, сахароза 3%, агар 0,8%). Через 30 дн образовавшийся каллус с каждого варианта переносят на каждый вариант среды второго этапа, содержащих разные кон- -JQ центрации ПУК и 2БАП в концентрации I1 мг/л (в случае каллуса из междоузлий) и 5 мг/л (в случае каллуса из листьев). Для образования эмбриоидов из эмбриогенного каллуса междоузлий значение концентрации 2БАЛ в среде второго этапа должно быть меньше 2 мг/л, л из эмбриогенного каллуса листьев - больше 2 мг/л. Далее продолжают культивировать при тех же условиях до появления эмбриоидов. При этом определяют концентрации 1 БАП и НУК, обеспечивающие индукцию эмбрио- идогенеза для данного гетотипа, т.е. БАПк и НУКк. /Для сорта Подарок Мага- 45 рача они были равны БАПк 2 мг/л, НУКк 2 мг/л.

Для получения генетически измененных растений эксперимент повторяют с тем отличием, что среды первого этапа содержат 2,4-Д в концентрации, большей или равной 2 мг/л, и 1БАЛ, в концентрациях, отличных от БАПк, т.е. в случае сорта Подарок Мягарача при 2,4-Д 2 мг/л + 1 БАИ 1 мг/л; при 2,4-Д 3 мг/л + 1 БАП 0,5; 1; 1,5; 2,5; 3,5; 4 и 5 мг/л. В средах второго этапа используют НУК п концентрации 2 мг/л и 2 БАП 1 мг/л в случае

40

50

55

дифференцированных листьев и образование соцветий у растений in vitro; различие в окраске побегов, размеров листьев и вызревание лозы. Установле на корреляция между использованной концентрацией 1 БАП и проявлением специфической изменчивости - образование соцветий у сомаклонов in vitro получение растений со специфической формой листа. Опыт повторяют три раза при исходной концентрации 1 БАП, при этом измененные признаки (Форма листа и образование соцветий) воспроизводились и сохранялись у вегета тивного потомства in vitro.

П р и м е р 2. Растения вырагтиваю по методике известного способа через соматический эмбриоидогенез также, как в примере 1, но берут только экс плантаты междоузлий растений сорта Подарок Магарача и в средах первого этапа используют фитогормоны 2,4-Д в концентрациях 1, 2 и 3 мг/л и 1 БА в концентрации 2 мг/л. Из 100 выращенных растений 5 растений имеют незначительные физиологические и морфо физиологические различия - по прирос ту, количеству междоузлий, приобретению осенней окраски листа и размерам листьев. Наблюдают спонтанное образование растений - регенерантов с определенным типом изменчивости от опыта к опыту.

ПримерЗ. По методике примера 1 в средах первого этапа использу ют фитогормоны 2,4-Д в концентрации -1 мг/л и 1 БАП в концентрациях, отли ных от БАПк, .2 мг/л. Образование эм5

35

-JQ 45

40

50

55

дифференцированных листьев и образование соцветий у растений in vitro; различие в окраске побегов, размеров листьев и вызревание лозы. Установлена корреляция между использованной концентрацией 1 БАП и проявлением специфической изменчивости - образование соцветий у сомаклонов in vitro, получение растений со специфической формой листа. Опыт повторяют три раза при исходной концентрации 1 БАП, при этом измененные признаки (Форма листа и образование соцветий) воспроизводились и сохранялись у вегетативного потомства in vitro.

П р и м е р 2. Растения вырагтивают по методике известного способа через соматический эмбриоидогенез также, как в примере 1, но берут только эксплантаты междоузлий растений сорта Подарок Магарача и в средах первого этапа используют фитогормоны 2,4-Д в концентрациях 1, 2 и 3 мг/л и 1 БАП в концентрации 2 мг/л. Из 100 выращенных растений 5 растений имеют не значительные физиологические и морфо- физиологические различия - по приросту, количеству междоузлий, приобретению осенней окраски листа и размерам листьев. Наблюдают спонтанное образование растений - регенерантов с определенным типом изменчивости от опыта к опыту.

ПримерЗ. По методике примера 1 в средах первого этапа используют фитогормоны 2,4-Д в концентрации -1 мг/л и 1 БАП в концентрациях, отличных от БАПк, .2 мг/л. Образование эмбриоидон из каллуса на втором этапе не наблюдают .

П р и м е р 4. По методике примера 1 в средах первого этапа используют фитогормоны 2,4-Д в концентрации 3 мг/л и 1 БАП в концентрации 0,5 и 5 мг/л. Образование эмбриоидов имеет место. 30% растений-регенеран- тов, полученных при использовании 1 БАП (5 мг/л), имеют специфическую форму листьев и у 10% растений образуются соцветия. Специфическая Форма листа сохраняется при вегетативном размножении, вплоть до десятого черенкования in vitro. Результаты воспроизводятся в повторных экспериментах, в случае использования 1 БАП в концентрации 5 мг/л. До 30% растений- регенерантов, полученных при использовании 1 БАП (0,5 мг/л) имеют измененную форму зубчиков листа, до 20% укороченные междоузлия и другие признаки, свойственные полиплоидным растениям.

Пример5. По методике примера 1 в средах первого этапа используют фитогормоны 2,4-Д в концентрации 3 мг/л и 1 БАП-БАПк 2 мг/л. Образование эмбриоидов из каллуса имеют место на втором этапе. Полученные растения- регенеранты (100 шт.) визуально ничем не отличаются от исходной формы.

Примерб. По методике примера 1 в средах второго этапа для каллуса из листьев используют НУК 2 мг/л и 2 БАП 0,5 и 1 мг/л, а для каллуса из междоузлий НУК 2 мг/л и 2 БАП 3 и 5 мг/л. Образование эмбриоидов не наблюдают.

Пример 7. По методике примера 1 в средах второго этапа для каллуса из листьев используют ИУК 2 мг/л и 2 БАП 5 мг/л, а для каллуса из междоузлий НУК 2 мг/л и 2 БАП 1 мг/л. Полученные результаты соответствуют результатам примеров 1 и 4.

Пример 8. По методике примера 1 в средах второго этапа для каллуса из листьев и междоузлий используют фитогормоны НУК в концентрации, отличной от НУКк (2 мг/л), и 2 БАЛ 1 мг/л (в случае каллуса из междоузлий) и 2 БАП 5 мг/.-т (в с |учлс к.ш- луса из листьев). Образование идов не наблюдают.

В табл. 1 представлены комбинации

регуляторов роста, исследованные для разных генотипов винограда. В табл.2 представлены комбинации регуляторов роста, необходимые для получения эмбриоидов.

Способ применим как один из этапов клеточных технологий для повышения их эффективности - получение массива измененных Форм из единичных

5 гибридных, мутантных или реконструированных растений и отбора наиболее удачно экспрессируемых геномов.

Формула изобретения

20

Способ получения растений винограда, включающий получение каллуса ия эксплантатов на модифицированной среде Мурасиге - Скуга в присутствии

6-бензиламинопурина и 2,4-дихлорфе- нилуксусной кислоты, перенос каллуса и культивирование до образования эмбриоидов на модифицированной питательной среде Мурасиге - Скуга в присутствии 6-бензиламинопурина ио6 нафтил- {уксусной кислоты и последующий перенос эмбриоидов на питательную среду для формирования растений, о т л и- чающийся тем, что, с целью

повышения выхода генетически измененных форм растений, в качестве эксплантатов используют междоузлия или листья, каллус получают в присутствии 2,4- дихлорфенилуксусной кислоты в количестве не менее 2 мг/л и 6-бензиламинопурина в количестве, отличном от специфичного для данного генотипа, образование эмбриоидов из эмбриогенного каллуса междоузлий осуществляют в присутствии 6-бензиламинопурина в количестве 1 мг/л и oi-нафтилуксусной кислоты в количестве, равном специфичному для данного генотипа, а при использовании в качестве эксплантатов

листьев количество 6-бензиламинопурина в питательной среде для образования эмбриоидов устанавливают равным 5 мг/л.

Содержание регуляторов роста, мг/л

,1;

Сорт Подарок Магарача Н-1; 2+Б-0.5 Н-1; 2;3+Б -1-5, Н (,5-2,5 + Б-1

3 D-2+ i-1;2

5Д-1+Б -3,5-6 Д-3+Б -0,1,0,5-5

6Д-4+Б.2; 3

7Д-1,5+Б-1

8Д-1; 2+5-1,7; 2,2 Д-2+Б-0,7; 0,9; 1,2; 1,9

9Д-1+Б -0,1; 0,5-6

10Д-НБ-4,5

11Д-2; З+Б-4,5

12Д-1+Б -4,3;4,7

13 Д-1+Б -0,1; 0,5-6

14 0-1+Б -0,1; 0,5-6 В-З+Б-2,5

Н-2+Б-1 Н-2+Б-1

Н-2+Б-5; 7

Н-2+Б-5

Н-2+Б-5

,5-3+Б-5

Н-2+Б-5

Н-2+Б-5

Н-2+Б-5

Сеянец Шгарач № 100-74-1-5

,5-3+Б-5 Н-1,5+Б-1;2;3;7 Н-1,5+Б-5 Н-1.5+Б-5 .

Сорт Крымская жемчужина

,5-3+Б-1

Vitis raonticol.a Buckl.

Н -0,5-3+Б-5

,5-3+Б-5 Н-З+Б-5

lUar no концентрации 0,5 мг/л. Шаг но концентрации 1 мг/л.

Сорт Подарок Магарача Н-2+Б-0.5; 1 Н-2+Б-0,5; 1 Н-2+Б-0.5; 1

,5; Н-2+Б-1

,1;П,9;1,2;1,9;3

Н-1,5; 2+Б-5 Н-1.5+Б-5 Н-2+Б-5 Н-2+Б-5

10 1 1 12

л- -

НБ-4,5 2, НБ-4,3

,5

;,7

Сеянец Магарач 100-74-1-5

Н-1,5+Б-3;5

Н-1.5+Б-5

Н-1.5+Б-5

Т а б ч и ц а 1

Н-1; 2+Б-0.5

Н-1; 2;

,5-2,5+Б-1;5

Н-2+Б-7; 8; 9;

Н-2+Б-5; 7

Н-2+Б-5

Н-2+Б-5

,5-3+Б-5

Н-2+Б-5

Н-2+Б-5

Н-2+Б-5

Н -0,5-3+Б-5

,5-3+Б-5 Н-З+Б-5

Таблица2

Н-2+Б-3; 5; 7; Н-2+Б-3; 5; 7 Н-2+Б-3; 5; 7 Н-2+Б-5 Н-2+Б-5

Н-1,5; 2+Б-5 Н-1.5+Б-5 Н-2+Б-5 Н-2+Б-5

13Д-1+Б-3

14Д-1;3+Б-2,5

Сорт Крымская жемчужина

Н-0,5;2+Б-1Н-0,5;2+Б-5

Vitis monticola Buckl.

Н-3-1-Б-5.

Продолжение табл.2