Способ обнаружения физиологически активных веществ растительного происхождения, обладающих антигрибной активностью Советский патент 1993 года по МПК A01N61/00 G01N30/90 

Изобретение относится к биологии, конкретно к биохимии растений и их защите от вредителей и болезней, и касается способов обнаружения веществ с антигрибной активностью.

Предлагаемый способ аналогов не имеет.

Сущность заявляемого способа заключается в том, что проводят исчерпывающую спиртовую экстракцию растений пшеницы и камедей, полученный экстракт очищают с помощью высокоскоростного центрифугирования, реэкстрагируют этилацетатом и хроматографируют в системе гексан - эти- лацетат - метанол (60 : 40 : 1), хроматограм- мы засевают грибом Ciadosporlum cucumerimum, с помощью которого обнаруживают места локализации антигрибного вещества, количественную оценку их физиологической активности проводят по подавлению прорастания уредоспор ржавчинного гриба in vitro.

Пример 1. Обнаружение ФАВ с помощью биоавтографии в листьях пшеницы.

Листья пшеницы (5 г) фиксируют кипя щим этанолом и проводят исчерпывающую экстракцию материала 80% раствором этанола до полного обесцвечивания растительного материала. Экстракт упаривают на ротационном испарителе при температуре не выше 40°С до водного остатка, который центрифугируют 30 мин при 10 тыс. об/мин.

Надосадочную жидкость экстрагируют трижды равным объемом этилацетата. Объединенный этилацетатный экстракт упаривают досуха в ротационном испарителе при температуре не выше 40°С, сухой остаток смывают небольшим количеством ( 4 мл) этилзцетата, который наносят на пластину, покрытую силикагелем (толщина рабочего слоя 2,0 мм). Хроматограмму развивают в системе гексан - этилацетаг - метанол (60 : 40 : 1). После подсушивания хроматограммы и тщательного проветривания для удаления следов органических растворителей ее засевают грибом Cladosporium cucumerinum и помещают во влажную камеру. Через 2 суток вся поверхность хроматограммы покрываются черно-зеленым мицелием гриба, и

(Л

С

00

ю

Јь

|Ј

0

только места расположения антигрибных веществ остаются белыми, т.к. эти соединения ингибируют развитие гриба (фиг. 1).

Пример 2. Обнаружение ФАВ в камедях. 10 г камеди экстрагируют 80% рас- твором этанола, экстракт упаривают досуха в выпарительной чашке. Сухой остаток смывают 3 мл 80% раствора этанола, подвергают хроматографическому разделению, как описано выше. После хроматографирова- ния проводят биоавтографию, как описано ьыше. Через 2 суток получают картину локализации антигрибного вещества (фиг. 2).

Пример ы1и2 позволяют обнаружить ФАВ в растительном материале и ви- з /ально, по размеру пятна ингибирования роста гриба Cladosporium cucumerium, оценивать их активность,

Пример 3. Количественная оценка, выделенных из растительного материала веществ, по подавлению прорастания спор ржавчинного гриба Puccinia recondite. Лис- ья пшеницы экстрагируют метанолом, экстракты концентрируют на ротационном изкуумном испарителе досуха, остаток растворяет в небольшом количестве метанола, наносят на препаративные хроматографи- чсские пластины с толщиной слоя в 2 мм. Хроматограммы развивают в системе хлороформ-метан-вода (325:175:36) и высушивают в вытяжном шкафу. Участки хроматограммы, соответствующие зонам подавления роста гриба Puccinia reconodita, счищают, многократно экстрагируют метанолом при встряхивании, экстракт центрифугируют и упаривают в выпарительных чашках досуха. Остаток растворяют в 1 мл горячей диет, воды, смешивают с 1 мл 2% агар-агара, наносят на предметные стекла, на которые затем напыляют споры ржавчинного гриба в количестве, исключающем са- моингибирование (не более 20-25 штук в поле зрения). Стекла помещают во влажную камеру на 16 ч, после чего под микроскопом

5

5

5

0

5

0

5

0

проводят подсчет проросших спор (в 10 полях зрения).

Суммарное среднее количество проросших спор по сравнению с контролем (чистый агар-агар) служит показателем токсического действия изучаемого вещества по отношению к прорастающим спорам облигатного патогена.

Этим же методом исследуют физиологическую активность растительных камедей (пример 2), Камеди (2 г) суспендируют с 1 мл 10% раствора этанола. Полученную суспензию смешивают с 1 мл 2% агар-агара и наносят на предметные стекла, на которые, после застывания агар-агара, напыляют споры ржавчинного гриба. Предметные стекла помещают во влажную камеру на 16 ч и затем под микроскопом подсчитывают количество проросших спор (10 полей зрения).

В опытах используются споры гриба, прорастаемость которых не ниже 80%. Физиологическая активность растительных экстрактов оценивается по подавлению прорастания уредоспор ржавчинного гриба. Статистическую обработку полученных данных осуществляют с помощью t-критерия Стъюдента. Достоверность различий оценивают при уровне вероятности Р 0,95.

Полученные данные представлены в таблице.

Таким образом, способ дает возможность обнаружить ФАВ растительного происхождения, обладающее антигрибной активностью.

Формула изобретения

Способ обнаружения физиологически активных веществ растительного происхождения, обладающих антигрибной активностью, заключающийся в том, что проводят спиртовую экстракцию растительного материала, очистку экстракта, выявление открываемых веществ методом биоавтографии и количественную оценку их активности по подавлению прорастания уредоспор ржавчинного гриба in vitro.

Продолжение таблицы

Использование: биология, биохимия растений и их защита от вредителей и болезней, обнаружение веществ с антигрибной активностью. Сущность изобретения: способ включает спиртовую экстракцию растительного материала, очистку экстракта и выявление открываемых веществ методом биоавтографии, количественную оценку их физиологической активности по подавлению прорастания уредоспор ржавчинного гриба in vitro. 2 ил.. 1 табл.

Капли

Кубанка - 3

фаг1

Л и TTJ К л ad

С,ипг ,Ј

. с/а. т а ъ

сРиа. 2