СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИЧЕСКОГО КОМПЛЕКСА Советский патент 1972 года по МПК C12P1/06 A23K1/17 

Изобретение относится к биологическому способу получения антибиотиков.

Известный способ включает культивирование продуцента из класса Streptomycetes в аэробных условиях на жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральных солей, при рН 5-8,8.

С целью получения комплекса либаномицина, состоящего из либаномицина А, либаномицина В и либаномицина С, в качестве продуцента берут Streptomyces libani п. sp. культивирование ведут в аэробных условиях на жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральных солей, при 22-37°С в течение 72-160 час и выделяют антибиотический комплекс известными приемами.

Для культивирования используют щтаммы S. libani F.I. 2343, F.I. 2399, F.I. 2501 и F.I. 2521, зарегистрированные в Institute of Microbiology of the Rutger University (США) под номерами LM.R.U.3915, I.M.R.U. 3916, I.M.R.U. 3917 и I.M.R.U. 3918 и в Commonwealth Мусоlogical Institute, Ferry Lane, Kew, Serrey (Великобритания) под номерами I.M.I. 130777, I.M.I. 130778, I.M.I. 130779 и I.M.I. 131233.,

Было обнаружено, что во встряхиваемой жидкой глубинной культуре они продуцируют антибиотический комплекс либаномицина.

Штамм F.I. 2343 был выделен из образц; почвы, взятой в г. Библосе (Ливан), щтам5 F.I. 2399 - из образца почвы, отобранной с рисового поля в Пьемонте, штамм F.I. 2501 - из образца почвы, взятой в Нидер-БеербахЗексгейме (ФРГ).

Морфологические признаки - общие для

всех штаммов, в то время как культуральные

V отдельных щтаммов несоклько отличаются.

Морфологические признаки

В обычных культуральных средах вегетативный мицелий состоит из более или менее тонких, длинных, обильно ветвистых гиф толщиной 0,4-0,8 мк, образующих более толстые гифы толщиной 1 -1,5 мк. На этих гифах имеются короткие боковые и густые спиральные ветви, чередующиеся или расположенные дру1 против друга с монополиальным ветвлением. Эти небольщие ветви в дальнейще.м превращаются в цепи спор, которые в начале связаны, а потом свободны. При наблюдении под электронным микроскопом споры имеют гладкую поверхность, которая бывает овальной или типичной почковидной, а зачастую и сфериче ской.

Таблица 1

Продолжение

Культуральные и биохимические свойства

В табл. 1 ириведены культуральные свойства каждого рассматриваемого штамма, выращенного в пробирках и в чашках Петри при 28°С. Наблюдения производят через 6,15 и 25 дней после инокуляции. Культуральные признаки мало различаются у отдельных штаммов. Воздушный мицелий довольно гладкий у штамма F.I. 2343, а иногда и у штамма F.I. 2501, и наоборот, хлопковидный в результате образования очень длинных спорофорных гиф у штаммов F.I. 2399 и F.L 2521.

Цвет воздушного мицелия белый у всех штаммов на одних органических средах и преимуш,ественно светло-коричневый на других органических и синтетических средах, однако на последних штаммы F.I. 2399 и F.I. 2521 могут иметь также оттенки серого цвета. Кроме того, штамм F.I. 2501 отличается от остальных трех штаммов тем, что производит пигмент красно-розового цвета, обусловливаюшего в известной степени также цвет вегетативного мицелия и, следовательно, цвет воздушного мицелия.

Помимо этого, штамм F.I. 2501 отличается от остальных трех штаммов тем, что усваивает 1-арабинозу и не разжижает желатину.

Рассматриваемые штаммы не восстанавливают нитраты до нитритов, не производят ни меланина, ни сероводорода. Они гидролизуют крахмал, сжижают желатину и исиользуют тирозин. Штаммы F.I. 2343 и F.I. 2521 пептонизируют и коагулируют молоко. Штаммы F.I. 2399 и F.I. 2501 коагулируют молоко но не пептонизируют его.

Для выр.ашивания штаммов применяют глюкозу, сахарозу, d-ксилозу, мезоинозит, d-маннозу, d-фруктозу, мальтозу и рафинозу.

Все четыре штамма не растут при 50°С и не производят склероциев, в глубинной и встряхиваемой среде они производят антибиотический комплекс либаномицииа.

Идентификация штаммов

По приведенным свойствам рассматриваемые микроорганизмы можно отнести к роду Streptomyces, Waksman et Henrici (Bargeys Мапца of Determinative Bacteriologi, 1957, 744-745; к разделу «Spira no Pridham ef al.

(Appl. microbiol., 1958, стр. 5). Однако эти штаммы нельзя отнести ни к какой из серий и, следовательно, ни к какому из видов, перечисленных в этом разделе. В действительности, в этом таксоне серия, включаюш,ая вид с воздушным мицелием коричневого цвета, характерного для штаммов F.I. 2343, F.I. 2399, F.I. 2501 и F.I. 2521, не иредусмотрена. Эти микроорганизмы нельзя отнести ни к какой из систематических групп, предложенных Waksman

(The Actinomycetes, 1961, 2, 111 и 117), а также ни к какой из групп, предложенных Baldacci (Giorn. Microbiol, 1958, 6, 10), потому что в этих таксонах серии или группы, включающие вегетативный мицелий желтого цвета и воздушный мицелий коричневого цвета, отсутствуют. По той же причине, они не могут быть отнесены как ни к систематическим группам, предложенным Flaig und und Kutzner (Arch. Mikrobiol, 35, 1960, 105-138), так и ни к видам, описанным Крассильниковым (Руководство для идентификации бактерий и актиномицетов, 1949 г., Моксва).

Рассматриваемые микроорганизмы следует отнести к новому виду, для которого предлагается название Streptomyces libani п. sp.

Для последовательных посевов микроорганизмы хранят в подходящей твердой среде для или посредством лиофилизации -их спор в МОл оке.

Источником углерода могут служить глюкоза, декстрин, крахмал, мука (соевая, кукурузная, пшеничная и т. п.), меласса, кукурузный экстракт, различные растительные масла и другие вещества, обычно применяемые для процессов брожения. Кроме вышеупомянутых комплексных азотсодержащих веществ, источником азота могут служить казеин, гидролизат казеина, барда и аммонийные соли, например сульфат, фосфат, хлорид аммония, и другие вещества, обычно применяемые для этой цели. Выбор минеральных солей зависит от используемой среды. Углекислый кальций почти всегда применяется. Могут быть добавлены также хлористый, сернокислый или фосфорнокислый натрий, соли калия, магния, железа, цинка и меди.

Брожение можно проводить в колбах Эрленмейера, в лабораторных, заводских ферментерах различной емкости.

Комнлекс либаномицина состоит из трех веществ, обладающих очень сходными между собой физико-химическими и биологическими свойствами. Этим веществам присвоены названия либаномицин А, либаномицин В и либаномицин С.

Антибиотическую активность бульонов и сырых продуктов определяют на чувствительном микроорганизме и сравнивают с активностью образцов, содержащих значительные количества антибиотика.

Содержание антибиотика в сырье определяют также спектрофотометрированием метанольных растворов при 284 ммк.

По окончании брожения антибиотический комплекс либаномицина, находящийся преимущественно в мицелии, экстрагируют подходящим растворителем, например спиртом или водным ацетоном, и осаждают. Получеиный осадок антибиотического комплекса очищают и разделяют на либапомицииы А, В и С с помощью хроматографии.

Например, мицелий экстрагируют спиртом или водным ацетоном, концентрируют экстракты до небольщого объема, осаждают сырой продукт, который промывают водой, сушат хлористым кальцием и промывают безводным ацетоном. Всплывающий слой и промывные воды после промывки сырого продукта приливают к профильтрованным бульонам, для выделения активного продукта из которых используют бутиловый спирт при рН 7,5-8,5 или катионообмениую карбоксильную смолу в Н-форме. Полученные бутанольные экстракты после промывки водой и упаривания до небольшого объема обрабатывают ацетоном или диэтиловым эфиром, получая активный сырой продукт. При использовании смол после адсорбции и промывки смолы водой и 0,5 н. раствором аммиака активный продукт элюируют водно-спиртовым раствором соли, например 3%-ным раствором хлористого натрия в метаноле (1:3).

рования бутиловым спиртом при рН 7,5-8,5 и осаждения экстракта ацетоном.

Полученный сырой продукт (концентрация ) растворяют в низкомолекулярном спирте и хроматографируют на колонке, заполненной нейтральным активированным глиноземом или силикагелем. Для элюироваиия используют спирт. Сначала получают либаиомицин В, а затем либаномицины А и С. Из элюатов выделяют антибиотики в виде белого аморфного порошка, содержащего 90-95% активного ингредиента.

Для анализа образцы антибиотиков доиолнительно пропускают через колонку, заполненную норощком целлюлозы, элюнруя смесью бутанол-пиридин-вода (6:4:3).

Либаномиции А представляет собой аморфный порошок, т. пл. 152-154°С (разложение); а 4-62,5° (, метанол). В УФ-спектре антибиотика обнаружены полосы поглощения, перечисленные в табл. 2.

Таблица 2

ji%

Xjiax, ммк

Среда 1 см

100, 107

244и 284 100, 102

245и 283

в ме101

ме284

70

перегиб при 255

Найдено, %: С 63,12; Н 8,05; N 6,49.

Реакции с РеС1з, КМп04, Вг2 положительны. , В присутствии конц. серной кислоты антибиотик имеет синий цвет, который переходит в фиолетовый.

Реакции Фелинга, нингридрина и Сакагучи отрицательиы. При хроматографии на бумаге антибиотик выявляют реагентами Буртона для фенолов и энолов, и реагентами Пан-Дутчера для амидов.

С реагентами Эрлиха он дает .желтое окрашивание.

Либаномицин А хорошо растворяется в водных сниртах, водном ацетоне, пиридине, ДМФА и ДМСО; растворяется в метаноле (20 мг/мл) и этаноле (4,5 мг/мл) и плохо растворяется в воде (1 мг/мл при 20°С и 5 мг/мл 0 при 50°С). Он не растворяется в ацетоне, хлороформе, бензоле, этиловом эфире и петролейном эфире.

Этот продукт быстро активируется в кислотах, стабилен при нейтральном или слабоще5 лочном рН, на свету, при комнатной температуре.

Либаномицин В представляет собой белый аморфный порошок, т. пл. 155-160°С (разложение); а -f72° (, метанол). 0 Найдено, %: С 64,34; Н 8,42; N 6,77.

УФ-спектр и Jipylnie физико-химические свойства либаномицина В такие же, как и у либаномицина А за исключением растворимости в этиловом спирте, которая выше для ли5 баиомицина В и составляет 10 мг/мл. УФ-спектр либаномицины С не отличается от соответствующих спекторов либаномицинов А и В. При хроматографии на бумаге при комнатной температуре антибиотики выявляют биоавтографией на Вас. subtilis. Используемые реагенты и Rt для соответствующих либаномицинов приведены в табл.3. Таблица 3 Антибиотик либо в виде комплекса либаномицина, либо в виДе одного из трех его компонентов - либаномицина А, либаномицина В и либаномицина С, очень активно воздействует на животных и его целесообразно добавлять в корм. Фармакология В табл.4 приведены значения микробиологической активности комнлекса либаномицина (в растворе 1000 мкг,1мл) в твердой среде. Таблица 4 Диаметр пятен ингибироМикроорганизмвания, мм S. aureus В. subtilis Р. vulgaris Mycobacterium sp., штамм 607 Mycobacterium phlei Candida albicans Токсичность либаномицина для мышей 1 г/кг при перроральном введении и 25 лгг/кг при внутривенном введении. Активность либаномицина онределяют опытным путем на 180 цыплятах при содержании в клетках. Цыплят делят на три группы по 30 кур и петущков в каждой. Первая получает основной корм, вторая - основной корм и 1 г,1ц либаномицина, третья - основной корм и 2 zju, либаномицина. Состав основного корма (в %): Кукуруза62,118 Обезвол енпая люцерна2,000 Дикальцийфосфат0,800 Углекислый кальций0,950 Хлористый натрий0,400 Габбомикс Р без антибиотиков0,500 с /-Метионин0,032 ический состав корма (в%): Вода11,78 Сырой протеин3,75 Клетчатка2,72 Зола5,07 Безазотистые экстрактивные вещества55,93 Кальций0,96 Фосфор0,72 должительность опыта 30дней. Резульпыта приведены в табл. 5.. Таблица 5 Пример I. Две колбы емкостью 300 лл заполняют 60 мл среды, содержащей (в %): Декстрин3,00 Казеин0,50 Кукурузный экстракт0,30 Углекислый кальций0,40 Сернокислый аммоний0,10 Днкалийфосфат0,01 Вода водопроводная До 100 Колбы стерплизуют 20 .шш при 120°С. рП среды после стерилизации 6,8-7. В каждую колбу вносят 2 мл суспензии спор, образующейся при промывке 5 мл дистиллированной воды налета культуры, полученной из 20-дневного F.I. 2343, выращенного на смеси картофель-глюкоза-агар в пробирке с косым срезом. Колбы, размеи1ениые на ротационном встряхивателе (эксцентриситет 3 см, скорость 225 об/мин), термостатируют 48 час при и 2 мл культуры инокулируют в другие колбы емкостью зоб мл, содержащие 60 м.л продуктивной среды следующего состава (в %): Крахмал Сернокислыи а м монии Углекислый кальций Обезжиренная соевая Моиокалийфосфат Хлористый натрий Сернокислый магний Сернокислый цинк Сернокислое железо Сернокислая медь Вода водопроводная

11

Раствор стерилизуют 20 мин при 120°С. После стерилизации рН 5,8. Культуру термостатируют при 28°С со встряхиванием, как указано в примере 1, через 120 час получают 150 мкг./мл продукта. 10 л сброжеиного бульона фильтруют через 2%-ный Суперсел, промывают водой и промывную жидкость приливают к профильтрованному бульону.

Влажный мицелий экстрагируют сначала 3 л метанола, а затем 2 л 80%-ного водного метанола.

Смешанные экстракты концентрируют в вакууме до 1/10 (500 Л1л) первоначального объема. Осадок отделяют, промывают водой, высушнвают в течение ночи в вакууме над хлористым кальцием нри 20°С и в течение 4 час нри 56°С над фосфорным ангидридом. Взвесь желто-коричневого иорошка в безводном ацетоие фильтруют и осадок высушивают. Получают 1,2 г 70%-ного комплекса либаномицина.

Профильтрованный бульон подщелачивают до рН 8,5 10%-иым углекислым натрием, встряхивают 1 час, фильтруют и фильтрат (11 л) дважды экстрагируют 1 об. бутилового спирта. Экстракт промывают водой, концентрируют в вакууме до 50 мл с прибавлением 10 об. ацето.на. Полученный осадок промывают ацетоном и высушивают.- Из профильтрованного бульона получают 0,500 г 70%-ного активного сырого продукта.

Пример 2. Повторяют те же операции, что и в примере 1, но продуктивиую фазу проводят на среде, содержащей (в %):

Декстрин4,00

Казеин1,00

Кукурузный экстракт1,00

Сернокислый аммоний0,20

Углекислый кальций0,50

Дикалийфосфат0,01 Вода водопроводная До 100

Раствор стерилизуют 20 мин при 120°С. После стерилизации рН 6,7-7. Раствор термостатируют при 28°С со встряхиванием, как в примере 1. Через 120 час получают 120 мкг/мл продукта.

Пример 3. Порядок операций такой же, как в примере 1, но продуктивную фазу проводят на среде, содержащей (в %):

Крахмал2,00

Барда1,75

Хлористый натрий0,25

Обезжиренная соевая мука 3,00 Соевое масло0,8 мл

Вода водопроводная До 100.

рН доводят до 7,2 едким натром, после стерилизации рН около 6,7.

Раствор стерилизуют 20 мин при 120°С, термостатируют при 28°С со встряхиванием, как в примере 1. После 120 час инкубации получают 100 мкг/мл продукта.

Пример 4. В колбу на 2000 мл с тремя углубления ги снаружи, образующими три ребра внутри колбы, и боковой шейкой для ипо12

куляции заливают 500 мл среды, указанной в примере 1 для вегетативной стадии, и стерилизуют ее 20 мин ири . После охлаждения колбу инокулируют суспензией спор, полученной промыванием стерильной дистиллироваиной водой налета трех культур в пробирке.

Колбу термостатнруют при 28°С и встряхипании (скорость 120 об/мин, эксцеитриситет 45 мм) в течение 38 час, 50 мл иолучеииой вегетативной культуры инокулируют 3 л среды, залитой в 5-литро1зые стеклянные ферментеры и имеющей следующий состав (в %):

Декстрин4,0

Казеин1,0 Кукурузный экстракт

(500/о-ный)1,0

Углекислый кальций0,5

Сернокислый аммоний0,1

Дикалийфосфат0,1 Вода водопроводная До 100.

Бульон встряхивают со скоростью 400 об/лшя и продувают 1 об. воздуха на 1 об. среды в 1 мин при 27°С в течение 24 час. В конце 5 этого периода отбирают 3 л мицелиевой суспензии и инокулируют в 50 ./г сбраживаемой среды, которая содержит (в %):

Крахмал4,0

Казеин1,0

Соевая мука3,0

Свекольная меласса0,2

Углекислый кальций0,4

Сернокислый магний0,1 Вода водопроводная До 100.

Среду стерилизуют 30 мин ири 12ГС и носле инокуляции встряхивают со скоростью 200 об/мин и продувают 0,7 л воздуха на 1 об. среды в 1 мин при 28°С в течение 110 час. Получают 110 мкг./мл антибиотика. 50 л полученного сбраживаемого бульона фильтруют через 2%-ный Суперсел. Влажный мицелий экстрагируют 15 л метанола и 10 л 80%-ного водного метанола. Экстракты упаривают до 4 л.

5 Осадок отделяют, промывают водой, высушивают, суспендируют в безводном ацетоне, фильтруют и высушивают. Получают 11,30 г 60%-ного сырого продукта. Маточные растворы и иромывиые воды приливают к профильтрованному бульону. Кальций удаляют, доведя рН раствора (55 л) до 6 едким илтром li прибавляя углекислый натрнй до рП 9,2. Смесь встряхивают 1 час, прибавляют 100 г инфузорной земли и фильтруют

5 для удаления углекислого кальция. После этого рП фильтрата доводят до 6 хлористым водородом, пропускают через колонку, содержащую 2 л Амберлита IRC в хлористоводородной форме. Смолу промывают 5 л воды,

5 л 0,5 II. раствора аммиака и 5 уг воды.

Элюирование проводят смесью 3 об. метанола и 1 об. 3%-ного водного раствора хлористого иатрия. Получают 6 л активного элюата, который уиарипают до 1,5 л в вакууме,

ют дважды 1 об. бутилового спирта. Экстракт промывают водой и концентрируют до 100 лгл. После прибавления 10 об. ацетона отделяют образующийся осадок, промывают, высушиваю-т и получают 3,25 г 60%-иого сырого продукта.

В 200 жл метанола суспендируют 14,40 г сырого продукта. Осадок неактивной фракции (1,40 г) отделяют, фильтрат пропускают через колонку, содержащую 300 г нейтрального глинозема, взвещенного в метаноле, промывают 3 л метанола и элюируют 80%-ным водным раствором метанола. Собирают фракции по 100 мл, следя за элюированием по спектрофотометру (отсчет показаний при 244 и-284 ммк), а затем анализируют методом хроматографии на бумаге, применяя в качестве растворителя смесь бутанол-пиридин-вода. Для проявления активных компонентов используют метод биоавтографии на Вас. subtilis.

Первые 20 фракций содержат либаномицин

В (Rf 0,78), а фракции от 21 до 30 содержат

смесь либаномицинов А н В (Rt 0,65 и Rf 0,78).

Фракции от 31 до 50 содержат либаиомицины А и С (Rt 0,65 и Rr 0,40).

Каждую группу фракций выпаривают отдельно в вакууме досуха. Остаток растворяют в этиловом спирте, фильтруют, концентрируют до небольшого объема и осаждают 10 об. ацетона. Осадки высушивают в вакууме нри над фосфорным ангидридом. Получают 1,80 г либаимицина В (90%-ный), 1,70 г либаиомицинов В и А (90%-ный) и 3,80 г либаномицинов А н С (90%-иый).

Раствор 1,40 г либаномицина А, содержащего также либаномицины В и С, в этиловом спирте (96°) пропускают через 25 г порошка целлюлозы, высушивают в течение ночи в вакууме над хлористым кальцием и помещают в хроматографическую стеклянную колонку, содержащую 225 г порощка целлюлозы. Смесь элюируют смесью бутанол-пиридин-вода (6:4:3), собирая фракции но 10 мл, которые анализируют хроматографией на бумаге, проявляя активные компоненты биоавтографией хроматограмм на пластинках агара, инокулированного Вас. subtilis.

Фракции 5-7 содержат либаномицин В, фракции 8-16 либаномицины А и В, фракции 17-24 либаномицин А, фракции 25-40 либаномиции А и следы либаномиципа С и фракции 41-45 либаномицин С. К каждой группе фракций приливают дистиллированную воду и петролейный эфир. Водную фазу экстрагируют 1 об. петролейного эфира, повторяя oneрацию три раза, добавляют этиловый спирт, упаривают досуха, растворяют остаток в этиловом спирте, полученный раствор фильтруют и концентрируют до половины первоначального объема. Добавляя 10 об. безводного ацетона, осаждают антибиотики в аморфном виде. Осадок отфильтровывают, промывают безводным ацетоном и высушивают над фосфорным ангидридом в вакууме при 56°С. Получают 30 мг либаномицина В; 120 мг либаномицина

А, содержащего следы либаномицнна В, 640 мг либаномицина А, 150 мг либаномицина А, содерл ащего следы либаномицина С, и 5 мг либаномицина С.

Пример 5. В 80-литровый ферментер нз нержавеющей стали вливают 50 л среды, описанной в примере 4, и стерилизуют 30 мин при 121°С. При 27°С ферментер засевают 500 мл вегетативной культуры, выросшей на той же среде в колбе, описанной в примере 4.

Ферментер продувают 0,7 об. воздуха на 1 об. среды и встряхивают 25 час. За это время рП доводят до 6,7 и получают бульон, готовый для засева.

Состав сбраживаемой среды (в %):

Крахмал Глюкоза

Углекислый кальций Соевая мука Сернокислый магний Вода водопроводиая

500 л среды стерилизуют 20 мин при 12ГС, после охлаждения до 27°С засевают 25 л выИ1еописанной вегетативной культуры, полученную смесь встряхивают со скоростью 210 и продувают 0,65 об. воздуха на 1 об. среды в 1 мин в течение 87 час. Получают 120 мкг/мл антибиотика.

450 л бульона фильтруют на фильтр-прессе с использованием 3%-ного Суперсела. Промытый водой, но еще влажный мицелий (86 кг) экстрагируют дважды 360 л 90%-ного водного метаиола. Экстракты концентрируют до 100 л в вакууме при 40-45°С. рП полученного концентрата доводят до 8,5. Концентрат экстрагируют сначала 70 л, а затем 20 л бутилового спирта. Смешанные экстракты промывают водой и концентрируют до 8 л в вакууме. Осадок фильтруют, промывают ацетоном и высушивают. Получают 180 г 20%-ного сырого продукта, содержащего либаномицины А, В и С.

Дальнейшее концентрирование полученного бутаиольного экстракта до 1 л и последующее осаждение 10 л ацетона позволяет дополнительно получить 208 г 20%-ного сырого продукта, состоящего из смеси трех антибиотиков.

Профильтрованный бульон и промывные воды (500 л) смещивают, доводят рН до 8,5, экстрагируют два раза 280 л бутилового спирта, полученный экстракт промывают водой и концентрируют до 25 л в вакууме. Неактивный осадок отделяют, фильтрат концентрируют до 2 л, ирибавляют 10 об. ацетона, полученный осадок промывают ацетоном, высушивают и получают 75 г 20%-ного сырого продукта, содержащего либаномицины А, В и С.

Предмет изобретения

1. Способ получения ангибиотического комплекса, включающий культивирование продуцента из класса Streptomycetes в аэробных условиях на жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минераль15ных солей, при рН 5-8,8, отличающийся тем, что, с целью получения комплекса либаномицина, состоящего пз либаномиципа А, либапомицина В и либаномицина С, в качестве продуцента берут Streptomyces libani п. sp., a5 культивирование ведут при 22-37°C в тече16пие 72-160 час и выделяют антибиотический комплекс известными приемами, 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что используют штаммы Streptomyces libani F. I. 2343, F.I. 2399, F.I. 2501 или F.I. 2521 (Societa Farmaceutici Italia).