Способ электрофоретического определения фракций серомукоида сыворотки крови Советский патент 1993 года по МПК G01N33/68 

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической биохимии.

Целью изобретения является повышение точности способа и количества выявляемых фракций.

Способ осуществляется следующим образом. К 0,5 мл сыворотки прибавляют 4,5 мл диет.воды и 2 мл 1,8 М хлорной кислоты, через 10 мин центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 минут. К супернатанту прибавляют 0,5 мл 5% фосфорно-вольфра- мовой кислоты в 2 н. HCI. Через 10 мин центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин. Осадок высушивают в той же центрифужной пробирке. К каждой пробе прибавляют по 0,1 мл 0,05 М трис-глицинового буфера рН 8,3 тщательно размешивают и высушивают при комнатной температуре.

Осадок, содержащий 200-300 мкг белка по биуретовой реакции, растворяют в 0,2 мл 0,005 М трис-глицинового буфере рН 8,3. В пробу добавляют 20 мкл 0.5% раствора до- децилсульфата натрия. Пробы используют для электрофоретического разделения

фракций в полиакриламидном геле, вносят в стеклянные трубки 90 мм длиной и 5 мм в диаметре, заполненные 5% концентрирующим и 10% разделяющим гелями. Для приготовления 10% разделяющего геля берут 1 мл раствора N 1, 2,8 мл раствора № 2, 0,2 мл НаО, 4 мл раствора № 3.

Пропись приготовления растворов следующая. Раствор NJ 1:1 н. HCI 48,0 мл, трис 36,6 г, ТЕМЕД 0,2 мл, довести дистиллированной водой до 100 мл. Раствор №. 2: акри- ламидЗОг N N-метиленбисакриламид 0,8 г, довести дистиллированной водой до 100 мл. Раствор INt 3: 0,14 г персульфата аммония довести до 100 мл водой. Конструирующий 5% гель приготовляют разведением раствора 10% геля дистиллированной водой в со- отношени /i 1:1

Разделение фракций проводят при силе тока 2 мА на труо,у в течение 65 мин. Окрашивание гелей - г 1 растворе алцианового синего в 7% уксусной кислоте. Фракии серомукоида скрашиваются в голубой цвет.

сл

С

00

го

-vl

о со о

П р и м е р. Из вены больного М. натощак взято 10 мл крови в сухую пробирку, которую поставили в термостат 37°С на 1 ч. Затем отделили сыворотку от сгустка крови стеклянной палочкой, предварительно проведенной через пламя горелки и остуженной. Для получения прозрачной сыворотки кровь центрифугируют при 1000 об/мин в течение 20-30 мин. Берут 0,5 мл сыворотки крови, добавляют4,5 мл диет,воды и 2 мл 1,8 М хлорной кислоты, через 10 мин центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин. К супернатанту добавили 0,5 мл 5% фосфор- но-вольфрамовой кислоты в 2 н,НС1. Через 10 мин пробы центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин. Осадок высушили. К каждой пробе добавили по 0,1 мл 0,05 М трис-глицинового буфера рН 8,3 и высушили при комнатной температуре. Осадок растворили в 0,2 мл 0,005 М трис-глицинового буфера рН 8,3. Взяли 130 мкл раствора, содержащего примерно 2/3 осадка или 200 мкг белка. В пробу добавили 20 мкл 0,5% раствора додецилсульфата натрия. Пробы нанесли на стеклянные трубки, заполненные 5% концентрирующим и 10% разделяющим гелями. Электрофорез проводили при силе тока 2 мА на трубку в течение 65

0

5

0

5

мин. Гели окрашивали в 1% растворе алци- анового синего в 7% уксусной кислоте. Былс выявлено в пробе, обработанной по прототипу 4 фракции, а по предлагаемому способу 7 фракций серомукоида.

Преимущества предлагаемого способа видны из таблицы.

Из данных таблицы видно, что по предлагаемому способу можно выявить достоверно большее число фракций серомукоида и повысить точность определения фракционного состава.

Формула изобретения

Способ электрофоретического определения фракций серомукоида сыворотки крови, включающий депротеинизацию сыворотки крови хлорной кислотой, осаждение серомукоида из супернатанта фосфор- но-вольфрамовой кислотой, растворение осадка в щелочи и переосаждение этанолом с последующим электрофорезом в полиак- риламидном геле и окрашиванием алциано- вым синим, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа и количества выявляемых фракций, перед электрофорезом проводят перерастворение осадка в 0,025-0,05 М трис-глициновом буфере рН 8,3 с последующим его высушиванием.

Использование: в медицине, в клинической биохимии. Цель: повышение точности способа и количества выявляемых фракций. Сущность изобретения: перед электрофорезом в полиакриламидном геле дополнительно проводят перерастворение осадка в 0,025-0,05 М трис-глициновом буфере рН 8,3 с последующим его высушиванием. Положительный эффект: использование изобретения позволяет почти на 35% больше выявить число фракций серомукоида сыворотки крови и на 20% повысить точность определения фракционного состава. 1 табл.