Способ идентификации В-лимфоцитов кур Советский патент 1991 года по МПК G01N33/48 

S

kfl

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к способу оценки иммунитета птиц. Цель изобретения - повышение производительности . способа и наглядности. Для этого из крови выделяют суспензию лимфоцитов4 проводят их электрофорез в геле, окрашивание фракций щелочной фосфота- зы, после чего проводят идентификацию В-лимфоцитов по окрашенной медленной фракции изофермента щелочной фосфатазы. Учет результатов ведут по балльной оценке интенсивности окрашивания.

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к способу оценки иммунитета птиц, и может быть использовано в ветеринарной клинической диагностике для оценки активности пролиферирующих клеток продуцентов антител о

Целью изобретения является повышение производительности способа и наглядности„

Способ осуществляется следующим образом.

Для выделения лимфоцитов кур берут в орошенную гепарином пробирку кровь в объеме до 2 мл, наслаивают на фи- кол-урографиновый градиент (d 1,082) в соотношении 2:1 и центрифугируют при 350g в течение 40 мин. Лимфоциты отбирают из интерфазы, трижды отмывают средой 199. Осадок ,лиифоцитов сохраняют при температура -20°С.

Для проведения электрофореза к 0,05 мл осадка лимфоцитов добавляют равный объем среды следующего состава: 60% сахарозы, 1% тритона Х-100, 1 кристалл броикрезолового красного, 4 и выдерживают 5-10 мин при комнатной температуре. Затем образцы лимфоцитов наносят на столбики с 4% концентрацией акриламида на трис-HCl буфере (рН 6,7) с добавлением 1% тритона Х-100 и разделяющего геля с 9%-ной концентрацией акриламида на трис-НС1- буфере рН 9,6 с добавлением 1% тритона Х-100.

Разделение белковых молекул проводят 240 мин. При силе тока 2-3 мА/ /трубку в электродном буфере рН 8,6 следующего состава : 1,2 г гидроокиси лития; 11,8 г борной кислоты; 20JO мл дистиллированной воды.

Ло окончании электрофореза для окрашивания образцов гели извлекают

05

оо

4 О J

OS

из трубочек и переносят в кювегу с инкубационной средой следующего состава: 5,0 мг нафтол-As-МХ-фосфат; 0,25 мл диметилсульфоксид; 25 мл вероналацетатного буфера рН 9,2; 25 мг прочного синего ББ.

Гели инкубируют с сыворотками крови в течение 20 мин при 37°С с образцами лимфоцитов в течение 24 ч в холодильнике.

Учет результатов проводят визуально. Максимальная интенсивность окрашивания обозначается как +++ и далее по степени снижения интенсив ности выражают как , + и отсутствие окрашенной чолосы отмечается

П р и м е р 1 Идентификация по медленному изоферменту щелочной фосф тазы В-лимфоцитоВс

Готовят суспензию лимфоцитов 15-дневных цыплят следующим обратом: кровь с гепарином в объем 3 до 2 мл наслаивают на фикол-упрографиповый градиент (d 1,082) в соотношении : и центрифугируют при 350g ДО мин, /.HI: Э1МТЫ триждп промывают средой

99, с ХРРЧЯЮТ при температуре -20 С оатем ;, 50 мкл осадка лимфоцитов до- бавля-от равный об РМ среды, содержащей 607 глхарг/зы, 1% трнточа Х-100 1 кристалл бромкрезоловтго красного. Через -1-10 лик наносят на столбики 4% концечтрируклгего гечя (трис-НС1, рН 6,7, с п,обТБлепием 1% тритона

Х-100) и 9 разделяющего геля (трио- НС, рН q,6, с добавлением 1% тритона Х-100) ,

Разделение белковых молекул проводят 240 мин при силе тока 2-3 мА/тру ку в .электродном буфере гидроокись - лития - борная кислот-ч (соответственно 1,2 г и 11,8 г на 2000 мл воды) рН 8,6.

После окончания электрофореза гель извлекают и окрашивают 24 ч лри 4°С в среде, содержащей 5,0 мг нафтол-Лз-МХ-фосфат; 0,25 мл диметил сульфоксид, 25 мп всронал-сцетатного буфера, рН 9,2; 25 мг прочного сине- го ББ„ Гель сохранялся в 7%-ном растворе уксусной кислоты,

Для получения члектрофореграммы щелочной фосфогазы сыворотки крови поступают следуюгднм образом. Кровь в объеме 1 мл после отслаивания сгуска центрифугирую11 15 мин при 350g, затем к О T- -JT добчвляют равный обье

5

0

5

5

сиецы следующего состава: 60% саха- розм, 1% тритона Х-100, 1 кристалл бэомкрезолового красного. Далее через 5-10 мин наносят на столбики с гглем и т.д. аналогично описанного

В-Л11Р ь

После окрашивания оба столбика с гелем анализируют и наблюдают наличие линии спектра синего цвета г одинаковой подвижностью. Следователь но, медленный изофермент щеточной фосфатаэы спектра сыворотки крови соответствует считанным В-лимфоцитам цыплят„

В пробе сыворотки крови дополни- тепьно набпюдалась быстрая фракция щелочной фосфатазы.

П р и м е р 2. Влияние ингибитора бурсы циклофосфана на спектр щелочной фосфатазы сыворотки крови.

Суточным цыплятам в течение трех дней вводят диклофосфан (ингибитор бурсы) в дозе 60 мг/кг. В возрасте 6 дней исследуют элоктрофореграмму лимфоцитов переферической крови.

С этой целью кровь с гепарином в обьеме до 2 мл берут от контрольных и опытных цыплят, наслаивают на фи- кол-урографиновыи градиент (d ) в соотношении 2:1 и центрифугируют при 350g 40 мин о Затем трижды промывают средой 199 и сохраняют при необходимости при температуре -20°С. Затем к 50мкп осатка лимфоцитов добавляют равный объем среды, содержащей 60% сахарозы, 1Z тритона ... и т.д., аналогично описанного в примере 1.

После окрашивания анализируют столбики гелей контрольной и опытной групп с, В контроле получают аналогично примеру 1 окрашенную синюю полосу, а в опытных столбиках - либо следы от соответствующих линии в контроле, либо вовсе отсутствие окраски о

Та; им образом, иммунодефицит В-лим- фппитов, вызванный циклофосфаном, ре- 1 истрируе ся при цитохими1Т- кс;-: икра- яивапии электрофореграмм из проб лимфоцитов крови птиц.

Способ является микрометодом, так как достаточно 50 мкл исследуемого ьатернага (лимфоциты, сыворотка кро- гн) , Способ позчоляет откалиброьать штенгивность слабовыраженного изо- фермента ,) как соотвотствую чегг 0,5 икг оепка, не требует наличия специфических антисиворот ок постановки опыта в день взятия крови, окрашивание может быть проведено сроком до 8 дней, доступен для интерпретации результатов сразу после цитохимтгческого окрашивания.

Производительность способа ограничена лишь конструкцией аппарата для проведения электрофореза (14-24 столбиков с гелем), тогда как при технике микроскопирования в день можно сделать заключение о 10-12 мазках в день.

Способ имеет безусловное преимущество в иллюстративности материала и позволяет быстро и наглядно оценить состояние В-иммунитета птиц.

Ф

р м у л а

изобретения

Способ идентификации В-лимфоци- тоо кур, включающий получение пробы крови, окрашивание лимфоцитов на щелочную фосфатазу и учет результатов, отличающийся тем, что, с целью повышения производительности и наглядности способа, из крови выделяют суспензию лимфоцитов, проводят электрофорез в геле и идентификацию В-лимфоцитов ведут по окрашенной медленной фракции изофермента„щелочной фосфатазы, а учет резул - тэтов осуществляют по балльной оценке интенсивности окрашивания.