Способ определения популяций лимфоцитов на мазках Советский патент 1993 года по МПК G01N1/28 

Изобретение относится -к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано в лабораторных исследованиях с целью определения иммунологического статуса организма.

Способ осуществляют следующим образом.

Мазок крови из пальца, предварительно обработанного спиртом, в течение 3 мин фиксируют в пазах нейтрального формалина, промывают дистиллированной водой и сушат.

Готовят инкубационную среду следующего состава.

10 мг Огнафтилацетата натрия растворяют в нескольких каплях ацетона. Таким же образом готовят раствор 20 мг нафтол-Аз- Фосфата. Полученные растворы субстратов последовательно вводят в общий ацетатный буферный раствор в количестве 40 мл, для приготовления которого 2,7 г уксуснокислого натрия предварительно растворяют в 100 мл дистиллированной воды и доводят рН

раствора до 5-5,4, используя для этого 50%- ную уксусную кислоту (раствор № 1).

4 г фуксина основного для фуксинсерни- стой кислоты растворяют в 100 мл 2N раствора HCI и получают в результате 4%-ный раствор парарозанилина. На дистиллированной воде готовят 4%-ный раствор натрия азотистокислого. Растворы парарозанилина и натрия азотистокислого смешивают по 8 капель каждого и после прохождения реакции азосочетания (1..1,5 мин при нормальных условиях) получают раствор № 2.

Раствор № 2 вводят в раствор № 1, полученную таким образом инкубационную среду нагревают до 37°С и помещают в нее подготовленный мазок. Время инкубации в термостате 1-2 ч. В ходе инкубации степень окраски контролируют под микроскопом.

Окрашенный мазок промывают дистиллированной водой и докрашивают для выяв- ления ядер клеток 1%-ным раствором метилового зеленого, отмытого хлороформом от фиолетовой фракции. Затем окончаё

00

СО Ю

00

-N

телько промывают, сушат и микроскопиру- ют с иммерсионным маслом при окуляре 10х и объективе 90. При этом в мазках крови одновременно выявляют активность неспецифической эстеразы в виде крупно или мелкогранулярной зернистости и кислой фосфатазы в виде темно-розовых пятен или средней и мелкогранулярной зернистости, ядра клеток окрашены в зеленый цвет.

Совместная окраска мазков на неспецифическую эстеразу и кислую фосфатазу позволяет установить, что при наличии в Т-лимфоцитах крупногранулярной зернистости, характерной для Т-хелперов, активность кислой фосфатазы выглядит в виде одного темно-розового пятна. Для темно- розовых пятна кислой фосфатазы мелкогранулярная зернистость характерна для Т-супрессоров. Для Т-киллеров характерна крупногранулярная зернистость кислой фосфатазы в виде округлых или полигональных гранул и мелкогранулярная зернистость. В-лимфоциты не выявляют активность обоих ферментов. В-активиро- ванные лимфоциты имеют мелкогрануляр- но-диффузную окраску кислой фосфатазы и мелкогранулярную окраску. 0-лимфоциты также имеют мелкогранулярную активность. Отличия В-активированных и 0-лим- фоцитов состоят в том, что первые имеют размер средних или больших лимфоцитов, а также меньшую плотность окраски ядра метиловым зеленым.

Следует указать, что правильность идентификации Т-супрессоров и Т-киллеров по активности кислой фосфатазы в сочетании с типом окраски на эстрезу соответствует тому, что в Т-супрессорах и Т-киллерах должна проявляется соответственно очень высокая и просто высокая активность кислой фосфатазы.

0

5

0

5

0

5

0

Предлагаемый способ позволяет на одном мазке и в один прием получить полную и достоверную информацию как о популяциях лимфоцитов, так и о субпопуяяциях Т- лимфоцитов, что делает его удобным и информативным при иммунологических исследованиях.

Ф о р м у л а и з о б р ете н и я

Способ определения популяций лимфоцитов на мазках крови путем инкубации в среде, содержащей нафтол-Аз-Фосфат, па- рарозанилин, натрий азотистокислый и ацетатный буфер, с последующим докрашиванием ядерным красителем и идентификацией клеток по размеру и наличию окрашенных гранул и лизосом, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа за счет выявления субпопуляцией Т-лимфоцитов, среда дополнительно содержит а-нафтилацетат натрия при следующих соотношениях компонентов, мае. %:

Нафтол AS-фосфат50,0...50.5

о-Нафтилэцетат натрия 25,0....25,5

Натрий азотистокислый

4%-ныйЗ.О...ЗИ

Парарозанилин 4%-ный 3,0...3,1

Ацетатный буфер

рН 5,0-5,2Остальное

и при наличии в клетке розовой лизосомы 5...7 мкм и темно-синих гранул определяют Т-хелперы, а розовых лизосом более одной и мелкогранулярной темно-синей зернисто- сти-Т-супрессоры, при наличии розовых лизосом 1,0...1.5 мк и темно-синей мелкогранулярной зернистости-Т-киллеры, а розовой и темно-синей мелко- и средне- гранулярной эернистости-0-лимфоциты и В-активированные лимфоциты, а при отсутствии лизосом и гранул в клетке- В-лимфоциты.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии. Целью является повышения точности способа за счет выявления на одном мазке субпопуляций лимфоцитов и Т-лимфоцитов. Цель достигается тем, что мазок красят средой одновременно на выявление активности кислой фосфотазы и неспецифической эстеразы. Дифференциация клеток проводится по характеру распределения в клетках гранул кислой фосфотазы и кислой неспецифической эстеразы. Способ позволяет выявить Т-суп- рессоры и Т-киллеры, 0-лимфоциты, В-акти- вированные лимфоциты и В-лимфоциты.