Способ обнаружения гомологичных нуклеотидных последовательностей Советский патент 1991 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к молекулярной биологии, в частности, может быть использовано при диагностических исследованиях в научно-исследовательских работах.

Цель изобретения - упрощение и ускорение способа.

Для этого антитела против гаптенизиро- ванной индикаторной последовательности получают иммунизацией животного любым гаптенизированным фрагментом нуклеиновой кислоты, антитела коньюгируют с их иммунохимической меткой, а обработку продукта взаимодействия гаптенизирован- ной индикаторной последовательности и исследуемой последовательности осуществляют непосредственно конъюгатом.

Пример 1. Для модификации ДНК с помощью М-ацетил-М-ацетокси-2-аминоф- люорена (АААФ) 5 мг ДНК (из тимуса теленка) растворяют в 5 мл 2 мМ

натрий-цитратного буфера (рН 7,0) и денатурируют кипячением в течение 10 мин. К раствору ДНК добавляют 5 мл раствора АААФ в 40%-ном этиловом спирте с концентрацией 1 мг/мл. Инкубируют при 37°С в темноте в течение 3 ч. Нерастворенный АААФ удаляют центрифугированием (1000 д, 5 мин, 20°С). Очистку супернатанта от АААФ проводят пятикратной экстракцией эфиром. К раствору добавляют 3 мл 3 М ацетата натрия (рН 4,8) 20 мл этилового спирта и выдерживают2 ч при -20°С. Осадок АААФ-ДНК собирают центрифугированием (5000 д, 5 мин, 20°С) и растворяют в физиологическом растворе в концентрации 0,6 мг/мл.

Иммунизацию кроликов проводят смесью модифицированной ДНК (АААФ- ДНК) с метилированным бычьим сывороточным альбумином (МБ С А). Для одной

О

ел ч

4 00 vj

инъекции смешивают 0,4 мл раствора АААФ-ДНК, 0,1 мл 0,25%-ного раствора МБСА, 0,5 мл полного адыованта Фрейнда. Смесь вводят в подушечкую лапы кролика четыре раза с недельным интервалом. За- тем с недельным интервалом делают три внутривенных инъекции смесью АААФ-ДНК с МБСА без адъюванта. Через неделю после последней инъекции у кроликов берут кровь.

Сыворотку крови отделяют центрифугированием (ЮООд, 10 мин, 20°С) и разводят физиологическим раствором в отношении 1:1. К 10 мл сыворотки добавляют 10 мл насыщенного раствора сульфата аммония и выдерживают при 4°С в течение 10 ч,Центрифугируют (5000 д, 10 мин, 4°С), осадок растворяют в 5 мл физиологического раствора и добавляют 2,5 мл насыщенного раствора сульфата аммония. Выдерживают при 4°С в течение 10 ч и центрифугируют (5000 д, 10 мин, 4°С). Осадок анти-ДНК иммуноглобулинов растворяют в 1 мл физио- логического раствора и диализуют в течение 48 ч при 4°С против физиологиче- ского раствора, затем лиофилизируют.

Для получения коныогата пероксидазы хрена с анти-АААФ-ДНК иммуноглобулинами 5 мг пероксидазы хрена растворяют в 0,45 мл 0,1 М карбонатного буфера (рН 9,3) и добавляют 0,05 мл 0,05 М раствора пери- одата натрия. Раствор активированной пероксидазы смешивают с 1,5 мл раствора анти-АААФ-ДНК иммуноглобулинов в 0,1 М карбонатном буфере (рН 9,3) с концентра- цией 10 мг/мл. К смеси добавляют 300 мг сухого сефадекса G-25 и выдерживают 3 ч в темноте, сефадекс удаляют фильтрацией. К фильтрату добавляют 0,4 мл раствора бор- гидрида натрия с концентрацией 5 мг/мл, Инкубируют при 4°С в течение 2 ч, затем доводят объем физиологическим раствором до 2,5 мл и прибавляют 2,5 мл насыщенного раствора сульфата аммония, Выдерживают при 4°С в течение 10 ч. Центрифугируют (5000 д, 10 мин, 4°С). Осадок конъюгата пероксидазы с анти-АААФ-ДНК иммуноглобулинами растворяют в 1 мл физиологического раствора и диализуют в течение 48 ч при 4°С против физиологического раствора. Добавляют глицерин до 50%-ной концентрации. Срок годности препарата не менее 1 года при температуре 5 ±3°С.

Полученный конъюгат пероксидззы с анти-АААФ-ДНК иммуноглобулинами ис- пользуют для выявления АААФ-ДНК. На нитроцеллюлозн-ый фильтр наносят в виде отдельных точек по Юмкл растворов АААФ- ДНК с концентрациями 10 мкг/мл, 1 мкг/мл, 100 мг/мл, 10 нг/мл, 1 нг/мл, 100

пг/мл и по 10 мкл растворов контрольной немодифицированной ДНК (из тимуса теленка) в тех же концентрациях. Фильтр с ДНК высушивают на воздухе в течение 30 мин. Препарат конъюгата пероксидазы с анти- АААФ-ДНК иммуноглобулинами разводят в отношении 1:200 фосфатно-солевым буфером (ФСБ), содержащим 7 мМ фосфорнокислого двухзамещенного натрия, 3 мМ фосфорнокислого однозамещенного натрия, 120 мМ хлористого натрия, 0,3% тви- на-20, 1,5 мг/мл яичного альбумина, рН 7,4. Фильтр с иммобилизованным ДНК выдерживают в течение 30 мин в буфере ФСБ, затем 1 ч в растворе коньюгата, разведенного в отношении 1:200 буфером ФСБ. Промывают фильтр три раза по 5 мин буфером ФСБ и окрашивают погружением его в раствор хромогенного субстрата, содержащий 0,2%-ный раствор бензидина в этиловом спирте, 10%-ный от насыщения раствор хлористого аммония, 20 мМ ЭДТА, рН 6,0, 0,3%-ный раствор перекиси водорода. Через 20 с положительные пробы окрашиваются в ярко-голубой цвет.

Конъюгат пероксидазы с анти-ДНК иммуноглобулинами выявляет не менее 10 мг АААФ-ДН К и не реагирует с немодифициро- ваниой ДНК.

Пример 2. Для модификации ДНК сульфированием 5 мг ДНК (из тимуса теленка) растворяют в 7 М мочевине до концентрации 1 мг/мл и денатурируют кипячением в течение 10 мин. К раствору ДНК добавляют 10 мл 3 М раствора 0-метилгидроксила- мина (рН 6,0) и 15 мл 2 М раствора метабисульфита натрия (рН 6,0). Инкубируют при 37°С в течение 8 ч затем диализуют против дистиллированной воды в течение 18 ч при 4°С. Добавляют 3 мл 4М ацетата натрия (рН 4,8) и 75 мл этилового спирта, выдерживают при -20°С в течение 2 с.

Образовавшийся осадок сульфированной ДНК (С-ДНК) собирают центрифугированием (5000 д, 5 мин, 20°С) и растворяют в физиологическом растворе в концентрации 0,6 мг/мл.

Иммунизацию кроликов, выделение ан- ти-С-ДНК иммуноглобулинов, получение конъюгата пероксидазы хрена с анти-С- ДНК иммуноглобулинами проводят по примеру 1. Полученный коньюгат пероксидазы с анти-С-ДНК иммуноглобулинами используют для выявления С-ДНК. На нитроцеллю- лозный фильтр наносят в виде отдельных точек по 10 мкл растворов С-ДНК с концентрациями 10 мкг/мл, 1 мк/мл 100 нг/мл, 1 нг/мл, 100 пг/мл и по 10 мкл растворов контрольной, немодифмцированной ДНК (из тимуса теленка) в тех же концентрациях.

Фильтр с ДНК высушивают на воздухе в течение 30 мин. Обработку фильтра конь- югатом пероксидазы с анти-С-ДНК иммуноглобулинами и окрашивание образующихся комплексов проводят по примеру 1.

Коньюгат пероксидазы с анти-С-ДНК иммуноглобулинами действительно выявляет не менее ЮОпг С-ДНК и не реагирует с немодифицированной

Таким образом, данное техническое решение значительно упрощает способ, так как универсальные антитела к применяемому гаптену могут быть получены заранее и, таким образом, отпадает необходимость каждый раз получать их к различным комплексам нуклеиновая кислота-гаптен. .Кроме того, использование для гибридизации конъюгата антител к гаптену с иммунофер- ментной меткой исключает использование анти-антител и позволяет применять антитела любого происхождения. Обработка продукта конъюгатом значительно упрощает способ, сокращает время на его осуществление, снижает трудоемкость способа, де-

лает его экономичнее при сохранении высокой специфичности и чувствительности.

Формула изобретения

Способ обнаружения гомологичных нуклеотидных последовательностей, включающий проведение гаптенизации последовательности ДНК и получение антител против гаптенизированкой последовательности ДНК, коньюгата с иммунофер- ментной меткой, проведение ДНК-ДНК гибридизации с гаптенизированным ДНК-зондом, регистрацию гомологичных последовательностей с помощью цммуно- ферментной реакции, отличающийся тем, что, с целью упрощения и ускорения способа, проводят иммунизацию животных гаптенизированной произвольной последовательностью ДНК, антитела против гаптенизированной последовательности ДНК коньюгируют непосредственно с иммуно- ферментной меткой, а иммуноферментную реакцию осуществляют непосредственно этим конъюгатом.

Изобретение относится к молекулярной биологии и медицине и может быть применено при диагностике инфекционных и наследственных болезнейЦель изобретения - упрощение и ускорение способа. Установлена возможность использовать антитела к конкретному гаптену для выявления любого гаптенизированного комплекса нуклеиновой кислоты с этим гаптеном, конъюгировать антитела к гаптену с иммуно- ферментной меткой для реакции гибридизации, а обработку продукта взаимодействия индикаторной и исследуемой последовательностей оснований проводить непосредственно конъюгатом с иммунохимической меткой.