Способ выделения вирусов при инапарантных острых и хронических формах флавивирусных инфекций Советский патент 1993 года по МПК C12N7/00 

Изобретение относится к медицине, в частности к вирусологии, и может быть использовано для диагностики вирусных инфекций.

Цель изобретения - повысить процент выделения вирусов из крови в ранние сроки инкубационного и лихорадочного периодов острых, а также хронических форм флавиви- русных инфекций для повышения качества диагностики этих инфекций.

Цель достигается путем выделения лейкоцитарной взвеси из гепаринизированной крови больного человека или животного, освобождения сконцентрированных лейкоцитов от плазмы, замораживания и оттаивания лейкоцитов для максимального выхода вируса из клетки.

Способ заключается в следующем. Кровь больного забирают из вены в количестве не менее 5 мл в раствор гепарина из расчета 25 ЕД на 1 мл крови, с последующим

отстаиванием крови в течение 45 мин при комнатной температуре. Затем тонким концом пастеровской пипетки отсасываем над- эритроцитариное белое облачко, состоящее из взвеси лейкоцитов, которые затем осаждаются центрифугированием при 1500 об/мин в течение 10 мин. Пастеровской пипеткой удаляется супернатант, в результате чего достигается освобождение от интерферона и других ингибиторов крови. Осадок из лейкоцитарной массы трижды замораживается в сухом льде или жидком азоте и оттаивается. Затем разводится в среде 199. Полученной биопробой заражается суточный монослой культуры клеток СПЭВ, выращенный в пробирках, с последующим повторным пассажем через 38 ч. Индикация и идентификация вируса производится по ЦПД, в гемагглютинирующих и иммуноферментных тестах. Период обработки материала и изоляции вируса занимает 5-6 дн. Все

сл

с

со

00

о

4

to

К5

СО

изолякты, полученные предлагаемым способом, подтверждены в биологическом тесте (на моделях 2-суточиых белых мышей).

Больные КЭ острой и прогредиентной форм у, лица с укусом клеща обследовались классическим способом (78 проб) и предлагаемым способом (92 пробы). В группе больных КЭ острой формы изолировано классическим способом 2 штамма вируса КЭ и 1 штамм вируса Повассан, что составило 6,9 ± 3,8% и предлагаемым способом - 4 штамма вируса КЭ, что составило 13,8 ± 6,1%. Несмотря на двухкратную разницу, эти показатели статистически не различались (р 0,05). В группе больных КЭ прогредиентной формы изолировано предлагаемым способом 3 штамма флавивируса от одного и того же больного, в то же время на 3 сгустков крови этого больного выделить вирус не удалось. У лиц с укУсом клеща вирус КЭ выделили только предлагаемым способом в пяти случаях, что составило 8,9 ± 3,8%. Всего из 78 проб крови классическим способом выделено 3 штамма (3,8 ± 2,1%), а из 92 проб лейкоцитарной взвеси предлагаемым способом выделено 12 штаммов (13,0 ± 3,5%). Разница этих показателей составила 3,4 раза и была статистически достоверной (р 0,05).

8 табл. 1 представлена сравнительная характеристика классического и предлагаемого способов вирусологической диагностики флавивйрусных-икфекций.

Пример 1. Для подтверждения вышеуказанных результатов проведена работа по изучению вйрусемии у морских свинок, прокармливающих самок таежного клеща, зараженных вирусом КЗ. Заражение клещей штаммами 493 (депонент ГКВ N 900) и 155 (депонент ГКВ № 704) вируса КЭ проведен на стадии нимфы. Слинявших молодых; самок и самцов парно тут же подсаживали в отдельные домихи, наклеенные на незараженных морских саинок. Продолжительность питания клещей составила 8-10 дн.

0

5

0

5

0

5

0

5

Кровь для исследования бралась из сердца регулярно от каждой морской свинки в разные сроки от момента присасывания (2,4,6, 11, 18 сутки). Изоляцию вируса проводили вышеуказанным способом.

Результаты исследования представлены в табл. 2.

Всего за 18 сут наблюдения получено 16 образцов крови, из которых в 13 случаях наблюдали изоляцию вируса КЭ из лейкоцитов, что составило 81,2%. Приведенные данные свидетельствуют о том, что заведомо зараженные питающиеся клещи способны вызывать длительную вирусемию от 2 до 18 сут, которая легко определяется с помощью предлагаемого способа.

П р и м е р 2, Изоляция флавивирусов при хлорическом персистентном течении инфекции.

Больной К., 38 л, в 1988 г перенес лихорадочное состояние неясной этиологии, в серологических тестах (РТГА и ИФА) выявлены специфические антитела к флавивиру- сам при многократном обследовании крови больного в период от 8 до 1 г 8 мес. Классическим способом возбудитель инфекции не выявлен. Проведено обследование больного предлагаемым способом. В период клинического ухудшения состояния больного изолировано 3 штамма вируса.

Обследована группа лошадей, у которых с помощью серологических методов установлена персистирующее течение флавивирусных инфекций.

Формула изобретения Способ выделения вирусов при инапа- рантных острых и хронических формах флавивирусных инфекций, включающий отбор пробы крови и последующее накопление вируса на биологическом объекте, отличаю- щ и и с я тем, что из крови получают осадок лейкоцитов, который трехкратно замораживают-оттаивают и разводят в среде 199.

Использование: медицина, в частности вирусологии. Сущность изобретения: из крови больного выделяют лейкоцитарную взвесь. Осадок из лейкоцитарной массы трижды замораживают в сухом льде или жидком азоте и трижды оттаивают. Затем разводят в среде 199. Полученной биопробой заражается суточный монослой культуры клеток СПЭА, выращенный в пробирках, с последующим повторным пассажем через 38 ч. Индикация и идентификация вируса производится по ЦПД в гемагглютинирую- щих и иммуноферментных тестах. 2 табл.

Та 6 л и ц.а 1

Таблица 2