СПОСОБ ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКИ КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА Российский патент 2003 года по МПК G01N33/569 

Изобретение относится к медицине, а именно к вирусологии, и может использоваться для экспресс-диагностики арбовирусных инфекций, в частности клещевого энцефалита (КЭ).

Известны способы диагностики арбовирусов:
способ диагностики арбовирусов: (Итоги науки и техники. Серия Вирусология. Т. 25. М., 1991, c. 60-61), включающий взятие проб крови у больных, получение сыворотки крови и исследование ее с помощью твердофазного иммуноферментного метода (ТИФМ);
способ диагностики клещевого энцефалита (Инструкция по применению тест-системы иммуноферментной для выявления антигена вируса клещевого энцефалита, утвержденная Госкомсанэпиднадзором России 25 июня 1995 г.), включающий взятие проб крови у больных, выделение сгустка крови и исследование его с помощью иммуноферментной тест-системы.

Недостатками данных способов являются нестабильные и низкие показатели выявления специфического антигена в крови больных арбовирусными инфекциями за счет низкой концентрации его в исследуемых образцах пробы.

Известно использование лейкоцитарной массы для выделения вирусов при инаппарантных, острых и хронических формах флавирусных инфекций (патент РФ, МКИ 5 С 12 N 7/00, 1836422 A3, от 23.04.91). При этом в пробу крови добавляют раствор гепарина из расчета 25 ЕД на 1 мл крови, отстаивают в течение 45 мин при комнатной температуре, отбирают лейкоцитарную взвесь, осаждают лейкоцитарную массу с помощью центрифугирования и для определения наличия арбовируса ее исследуют на модели клеточной культуры СПЭВ.

Недостатком данного способа является длительность и трудоемкость диагностики арбовирусных инфекций, что не позволяет использовать его для экспресс-диагностики этих инфекций.

Задача предлагаемого технического решения - повышение скорости и процента выявления антигена вируса клещевого энцефалита у людей в раннем инкубационном периоде.

Задача решается за счет забора крови у больных и у лиц с укусом клеща, выделение из свежевзятой пробы крови лейкоцитарной массы и исследование ее в иммунноферментном анализе (ИФА). Причем исследование лейкоцитарной массы проводят в день забора крови.

Предлагаемый способ повышает процент выявляемости антигена вируса КЭ в крови людей в раннем инкубационном периоде, за счет выделения из нее сенсибилизированных лимфоцитов с адсорбированными на них вирусными частицами и антигенами, при этом выделение из свежевзятой пробы крови лейкоцитарной массы и исследование ее в день забора крови позволяет выделить максимальное количество антигена вируса КЭ.

Задача решается следующим образом. Кровь больного забирают из вены шприцом в количестве 5-10 мл, переносят в стерильную пробирку с раствором гепарина из расчета 25 ЕД на 1 мл крови, отстаивают в течение 50-60 мин при температуре 23-25^oС или в течение 25-30 мин в термостате при температуре 35-37^oС. Затем тонким концом пастеровской пипетки отсасывают лейкоцитарную взвесь, отмывают рабочим раствором (РР), прилагаемым к тест-системе ИФА (инструкция прилагается) и осаждают центрифугированием при 1500 об/мин в течение 10 мин. Удаляется супернатант. Полученную лейкоцитарную массу исследуют в день забора крови в иммуноферментном анализе.

Добавление гепарина в свежевзятую кровь позволяет разделить форменные элементы крови и выделить лейкоцитарную взвесь путем отстаивания, а добавление рабочего раствора и последующее центрифугирование взвеси дает возможность получить очищенную и сконцентрированную лейкоцитарную массу.

Изобретение соответствует критерию "новизна" т.к. в ИФА исследуют только сконцентрированную лейкоцитарную массу, лимфоциты которых являются универсальными специфическими адсорбентами антигенов и вируса КЭ. Причем рецепторы сенсибилизированных лимфоцитов сохраняют свою оптимальную активность в день забора крови.

Примером эффективности заявляемого изобретения послужили сравнительные опыты по выявлению антигена вируса КЭ из элементов крови при различных условиях их обработки у лиц, обратившихся в лабораторию по поводу "укуса" клеща. Реакции проводили с российской Тест-системой иммуноферментной для выявления антигена вируса клещевого энцефалита МЗ РФ ФГУП НПО "Вирион" (г. Томск) согласно приложенным указаниям. Результаты учитывали на фотометре для ИФА по оптической плотности (ОП) при длине волны 492 нм. Положительными результатами считались только те пробы, которые имели показания выше "пороговой" величины (К = не менее 2,1).

В опыты были взяты следующие элементы крови:
1) лейкоцитарная масса, обработанная вышеуказанным способом;
2) лейкоцитарная масса после обработки азотом;
3) лейкоцитарная масса, обработанная вышеуказанным способом и выдержанная при температуре 4-6^oС более 18 часов;
4) эритроцитарная масса;
5) плазма;
6) плазма, гретая при температуре 56^oС в течение 20 мин.

Таким образом исследованы 73 пробы крови. В эритроцитарной массе, гретой плазме и охлажденной лейкоцитарной массе путем обработки азотом, антиген вируса КЭ не обнаружен. В лейкоцитарной массе, выдержанной при температуре 4-6^oС более 18 часов, антиген вируса КЭ обнаружен в 7,2% в плазме - в 4,8% случаев (К= 2,1), а в лейкоцитарной массе, обработанной предложенным способом, - в 26,0%. Полученные результаты свидетельствуют о том, что заявляемый нами способ экспресс-диагностики является высокоспецифичным и надежным для экспресс-диагностики КЭ в раннем инкубационном периоде у лиц, обратившихся с "укусами" клеща, а также в период вирусемии у больных КЭ.

Эффективность использования лейкоцитарной массы для определения антигена, показана на примере, степени инфицированности людей вирусом КЭ, обратившихся в лабораторию по поводу "укуса" клеща. За период с 1995 по 2000 гг. обследовано 4096 человек спустя сутки и более после укуса клеща. Антигенемия к вирусу КЭ выявлена в ИФА у 1144 человек, что составило 27,9% положительных результатов. Повторно, спустя 10-30 дней, обследовано 230 человек, у которых антиген вируса КЭ сохранялся у 44% лиц. Трехкратно и более в период от 2-х месяцев до 1,5 лет обследовано 37 человек, антиген вируса КЭ выявлялся в 64% случаев. Это свидетельствовало о том, что процесс элиминации вируса КЭ из организма у некоторых лиц был замедлен, показана возможность длительного персистирования антигена вируса КЭ без клинического проявления инфекционного процесса.

Таким образом, данный метод позволяет диагностировать не только свежие случаи зараженности вирусом, но и длительное персистирование вируса при инаппарантных формах инфекции.

Пример конкретного применения.

Для подтверждения вышеуказанных результатов проведены исследования 73 человек с укусом клеща. Кровь больного забирали из вены в количестве 5-7 мл в раствор гепарина из расчета 25 ЕД на 1 мл крови, с последующим отстаиванием крови в течение 60 мин при температуре 24^oС. Из этой крови выделяли лейкоцитарную взвесь, которую отмывали рабочим раствором, прилагаемым к тест-системе ИФА. Затем лейкоцитарную взвесь осаждали центрифугированием при 1500 об/мин в течение 10 мин. Удаляли супернатант. Лейкоцитарную массу исследовали в ИФА в день забора крови. В лейкоцитарной массе выявили антиген к вирусу КЭ в 26,0%. Из них показатели пороговой величины (К) в положительных пробах распределились следующим образом: К = от 2,1 до 3,0 (21,1%); К = 3,1-5,0 (47,4%); К=5,1-7,0 (21,1%); К = более 7,1 (10,5%).

Предлагаемый нами способ прост и экономичен в использовании как для научных исследований, так и в практической медицине для выявления на ранних стадиях инфицированности арбовирусами больных в период вирусемии, что позволяет назначить своевременное лечение.

Изобретение относится к медицине, а именно вирусологии, и может быть использовано для экспресс-диагностики клещевого энцефалита. Сущность способа состоит в том, что у лиц с укусом клеща проводят забор крови, кровь берут из вены в объеме 5-10 мл в пробирку с раствором гепарина из расчета 25 ЕД на 1 мл крови, отстаивают в течение 50-60 мин при 23-25^oС или в течение 25-30 мин при 35-37^oС, отбирают лейкоцитарную взвесь из верхнего слоя пробы, отмывают ее рабочим раствором, лейкоцитарную массу осаждают центрифугированием 10 мин при 1500 об/мин, при этом исследование проводят в день забора крови и по наличию в лейкоцитарной массе специфических антигенов диагностируют клещевой энцефалит. Техническим результатом является повышение скорости и процента выявления антигена вируса клещевого энцефалита в раннем инкубационном периоде.

Способ экспресс-диагностики клещевого энцефалита (КЭ) путем выявления антигена вируса КЭ иммуноферментным анализом крови, отличающийся тем, что забор крови проводят у лиц с укусом клеща, кровь берут из вены в объеме 5 - 10 мл в пробирку с раствором гепарина из расчета 25 ЕД на 1 мл крови, отстаивают в течение 50 - 60 мин при 23-25°С или в течение 25 - 30 мин при 35 - 37°С, отбирают лейкоцитарную взвесь из верхнего слоя пробы, отмывают ее рабочим раствором, лейкоцитарную массу осаждают центрифугированием 10 мин при 1500 об/мин, при этом исследование проводят в день забора крови и по наличию в лейкоцитарной массе специфических антигенов диагностируют клещевой энцефалит.