СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ АРБОВИРУСОВ, В ЧАСТНОСТИ КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА Российский патент 2003 года по МПК A61K35/76 C12N7/08 G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, а именно к вирусологии, и может использоваться для вирусологической диагностики арбовирусных инфекций, в частности клещевого энцефалита.

Известен способ выделения арбовирусов (патент РФ 1836422 A3, МКИ 5 С 12 N 7/00, от 23.04.91), включающий забор крови у больных и у лиц с укусом клеща, выделение лейкоцитарной массы крови, освобождение от ингибиторов и последующего 2-кратного пассажа на монослой культуры клеток СПЭВ.

Недостатком данного способа является низкий процент изоляции вируса за счет использования культуры клеток СПЭВ, на которой не выделяются невирулентные штаммы вируса.

Наиболее близким по технической сущности является способ выделения арбовирусов (Итоги науки и техники. Серия Вирусология, т.25, М., 1991, с. 22-27), включающий сбор подозрительного на зараженность материала, подготовку его к исследованию и выделение высоковирулентных штаммов арбовирусов путем внутримозгового и подкожного заражения 1-3-дневных подопытных животных 10%- ной суспензией исследуемого материала с последующим отбором заболевших животных, забором у них мозга и 3-4-кратных пассажей для накопления в мозге нейротропных вирусов в достаточном количестве.

Недостатком данного способа является низкий процент изоляции вируса за счет выделения только высоковирулентных нейротропных штаммов.

Задачей данного изобретения является повышение качественных и количественных показателей вирусологической диагностики за счет выделения не только высоковирулентных, но и слабовирулентных штаммов арбовирусов, в частности клещевого энцефалита.

Задача решается следующим образом:
- сбор подозрительного на зараженность материала,
- подготовка его к исследованию,
- выделение вируса за счет комбинированного заражения в мозг и под кожу 1-3-дневных подопытных животных,
- отбор животных с манифестной формой инфекции,
- забор у них мозга и последующий 3-5-кратный пассаж для накопления в мозге нейротропных вирусов в достаточном количестве для его идентификации,
- исследование мозга и селезенки, животных с инаппарантной формой инфекции известным способом в иммуноферментном анализе (ИФА) на 7, 14, 21-е сутки,
- отбор проб с наличием положительного теста на антиген арбовирусов,
- проведение последующих 3-5-кратных пассажей для накопления иммунотропных вирусов в достаточном количестве для их идентификации.

Сущность способа заключается в следующем. В качестве исследуемого материала могут быть использованы:
- непосредственные носители арбовирусов - клещи, комары и др.;
- кровь лиц с "укусом" насекомых и клещей;
- лейкоцитарная масса крови людей и животных;
- кровь и органы больных людей и животных с подозрением на инфицирование арбовирусами.

Исследуемый материал готовят в соответствии с общепринятыми методиками. Для выделения арбовирусов производят заражение 1-3-дневных белых мышей или других подопытных животных, в частности новорожденных хомячков, сосунков крыс или морских свинок, комбинированно внутримозговым и подкожным способами. Материал проб, способный пассироваться через мозг белых мышей и вызывать у них клинику заболевания, обладает нейровирулентными свойствами. Мозг этих мышей принимают за типичный нейротропный штамм.

У животных, зараженных пробами, которые не вызывают заболевание, мозг и селезенку исследуют известным способом в иммуноферментном анализе (ИФА). Пробами, давшими положительный результат в ИФА, комбинированно внутримозговым и подкожным способами заражают 2-дневных белых мышей. За зараженными животными ведется наблюдение в течение 2-3 недель. У этих мышей обследуют мозг и селезенку в ИФА на 7, 14 и 21-е сутки наблюдения. Мозг клинически здоровых мышей при отрицательных результатах ИФА дальнейшим пассажам не подвергают. Из положительных проб селезенки готовят 10%-ную суспензию, проводят пассажи на 2-суточных белых мышах. Возможность многократного пассирования изолята только через иммунокомпетентные органы указывает на выделение иммунотропного штамма вируса КЭ. Идентификацию штаммов вируса проводят в МФА и РТГА.

Пробы лейкоцитарных масс крови от лиц с укусом клеща обследованы с использованием культуры клеток СПЭВ (655 проб) и предлагаемым способом (92 пробы). В первой группе изолировано 53 нейротропных штаммов вируса КЭ, что составило 8,0%. Во второй группе изолировано 48 штаммов, что составило 52,2%. Из них выделено 14 нейротропных штаммов (15,2%) и 34 иммунотропных штаммов (36,9%). Разница показателей между первой и второй группами составила 6,5 раз. Это свидетельствует о том, что с помощью ранее применяемых способов не выделяли иммунотропные штаммы вирусов, которые составляют основную массу вирусной популяции, вызывающей, как правило, стертые и инаппарантные формы заболевания.

Примером накопления специфического антигена в селезенке мышей, зараженных 10-ю висцеротропными изолятами, явился опыт титрования 10%-ной суспензии иммунокомпетентных органов (10¹-10¹⁰) с последующим заражением клеточной культуры СПЭВ. Из этих клеток спустя 5 суток были приготовлены слайды по общепринятой методике МФА. Для каждого штамма получены показатели накопления вируса на 7 и 14-е сутки с помощью непрямого метода флюоресцирующих антител с использованием иммунной сыворотки крови больного КЭ в разведении 1: 20 и коньюгированной сыворотки против глобулинов человека. В табл. 1 представлены данные, подтверждающие присутствие в иммунокомпетентных органах, в частности в селезенке, специфического антигена (в ИФА) и вируса КЭ (в МФА). Титры его достигали до 10^-7.

Другим примером, свидетельствующим в пользу антигенной принадлежности к вирусу КЭ этих же 10-и изолятов, полученных предлагаемым способом, являются результаты их идентификации. Для проведения РГА и РТГА готовили протаминсульфатный антиген из вируссодержащего иммунокомпетентного органа. При постановке РТГА использованы мышиные иммунные сыворотки к региональным штаммам Пищелкин (выделен из мозга умершего больного) и 828 (выделен из крови человека с инаппарантной формой КЭ), а также коммерческая иммунная сыворотка к стандартному вирусу КЭ.

Из данных табл. 2 видно, что все штаммы обладали гемагглютинирующими свойствами в титрах 64-128 АЕ. В РТГА выявлены более высокие специфические связи к штамму 828. Иммунные сыворотки к штамму Пищелкин реагировали слабее. Это свидетельствует об антигенной близости изучаемых изолятов к штамму 828, который также выделен из крови больного с инаппарантной формой КЭ.

Пример конкретного применения. Кровь лиц с укусом клещей (92 человека) забирают из вены в количестве 5 мл в раствор гепарина из расчета 25 ЕД на 1 мл, отстаивают в термостате при температуре 37^oС в течение 30 минут, отбирают лейкоцитарную взвесь и получают лейкоцитарную массу. Ею заражают в мозг и подкожно 92 семьи из 6-ти двухдневных белых мышей. Наблюдают за ними в течение 14 дней. Из общего количества зараженных семей у 14 проявились симптомы заболевания (малоподвижность, параличи, смерть). Это говорит о том, что 15,2% обследованных лиц с укусом клеща являются носителями нейротропных вирусов.

Из оставшихся мышиных семей с инаппарантной формой течения инфекции на 14 сутки взяты мозг и селезенка мышей-сосунков, приготовлены пробы для исследования в ИФА и проведен анализ согласно инструкции по применению тест-системы иммуноферментной для выявления антигена вируса КЭ (инструкция прилагается). При этом ни в одной из этих проб антиген вируса КЭ в мозге не обнаружен. Пробы селезенок с отрицательными результатами дальнейшим исследованиям не подвергаются.

Остальные пробы из селезенок с наличием антигена КЭ пассировали на сосунках белых мышей. При этом каждые 7, 14, 21-е сутки проводили исследования селезенок в ИФА. Из всех исследованных проб выделено 34 иммунотропных штаммов, что составило 36,9%. Полученные результаты свидетельствуют о том, что эти лица с укусом клеща заражены иммунотропными штаммами вируса КЭ. Такие случаи ранее не диагностировались, люди оставались без специфического лечения.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить качественные и количественные показатели вирусологической диагностики за счет использования иммунокомпетентных органов.

Изобретение относится к медицине, а именно к вирусологии, и может использоваться для вирусологической диагностики арбовирусных инфекций, в частности клещевого энцефалита. Сущность изобретения состоит в сборе подозрительного на зараженность материала, подготовке его к исследованию и выделению арбовирусов путем комбинированного заражения 1-3-дневных подопытных животных в мозг и под кожу суспензией этого материала. У животных с манифестной формой инфекции производят забор мозга, готовят из него суспензию и проводят последующие 3-4-кратные пассажи в мозг подопытных животных этой суспензией для накопления нейротропных вирусов в достаточном количестве для идентификации. У животных с инаппаратной формой инфекции дополнительно исследуют нейро- и иммунокомпетентные органы известным иммуноферментным методом на 7, 14, 21-е сутки. Пробы иммунокомпетентных органов с наличием положительного теста на антиген арбовирусов отбирают и готовят из них суспензию, проводят 3-5-кратные пассажи путем заражения подопытных животных этой суспензией для накопления иммунотропных вирусов в достаточном количестве для идентификации. Технический результат - расширение арсенала диагностических методов при поражении арбовирусами. 2 табл.

Способ выделения арбовирусов, в частности клещевого энцефалита, включающий сбор подозрительного на зараженность материала, подготовку его к исследованию и выделение арбовируса путем комбинированного заражения 1-3-дневных подопытных животных в мозг и под кожу суспензией этого материала, отбор животных с манифестной формой инфекции, забор у них мозга, приготовление из него суспензии и последующие 3-4-кратные пассажи в мозг опытных животных этой суспензией для накопления нейротропных вирусов в достаточном количестве для идентификации, отличающийся тем, что у животных с инаппарантной формой инфекции дополнительно исследуют нейро- и иммунокомпетентные органы известным иммуноферментным методом на 7, 14, 21-е сутки, причем пробы мозга с отрицательным результатом уничтожают, а пробы иммунокомпетентных органов с наличием положительного теста на антиген арбовирусов отбирают, готовят из них суспензию и проводят 3-5-кратные пассажи путем заражения подопытных животных этой суспензией для накопления иммунотропных вирусов в достаточном количестве для идентификации.